破壁灵芝孢子粉甾醇类HPLC指纹图谱的建立及其抗肿瘤活性“谱效”关系

简伟明，刘小慧，梁慧佳，李洁仪，焦春伟

(广东粤微食用菌技术有限公司，广东 广州 510663)



破壁灵芝孢子粉甾醇类HPLC指纹图谱的建立及其抗肿瘤活性“谱效”关系

简伟明，刘小慧，梁慧佳，李洁仪，焦春伟

(广东粤微食用菌技术有限公司，广东 广州 510663)

建立了破壁灵芝孢子粉甾醇类高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的分析方法，采集了10批不同产地破壁灵芝孢子粉HPLC图谱，运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版”软件建立破壁灵芝孢子粉标准图谱。并利用生物细胞模型技术得到了10批破壁灵芝孢子粉样品粗甾醇提取物的抗人恶性乳腺癌细胞(MT-1)抑制率曲线及半数有效剂量(IC50)，运用多元线性回归统计方法，将抗肿瘤活性参数IC50与HPLC指纹图谱共有峰的标准化峰面积比值关联。结果表明：方法的稳定性、精密度、重现性符合方法学要求；建立的甾醇类HPLC指纹图谱共得到15个共有峰，各样品图谱与标准指纹图谱的相似度均在0.9以上。经抗人恶性乳腺癌细胞活性参数IC50研究及统计分析表明，指纹图谱中与抗人恶性乳腺癌细胞活性关系密切的峰为1、3、6、8、9、14号，即麦角甾醇等6个成分是其主要活性成分。

破壁灵芝孢子粉；甾醇；高效液相色谱(HPLC)；指纹图谱；抗肿瘤活性；“谱效”关系

灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来的极其细小的孢子，具有灵芝的全部遗传活性物质，但由于灵芝孢子壁是一层既不溶于水，也不溶于酸的几丁质，孢子进入肠胃后，有效成分无法被人体吸收利用，因此其深加工产品破壁灵芝孢子粉更为广大消费者所接受。因此，有必要建立有效的检测方法对破壁灵芝孢子粉产品质量进行控制。

研究表明，破壁灵芝孢子中富含人体必需氨基酸、糖肽、甾醇、生物碱和三萜类等物质[1]，而其中粗多糖与总三萜是目前获得业内公认的功效评价指标，一般检测方法仅是分光光度法[2-3]，在特异性方面稍存局限，并且无法反映出破壁灵芝孢子粉的整体信息。而破壁灵芝孢子粉中甾醇类物质鲜有报道。

灵芝中甾醇类物质含量丰富，其中麦角甾醇含量可达0.3%[4]，已知从灵芝中分离提取到的甾醇有麦角甾醇、羊毛甾-7,9(11)，24-三烯-3β，21-二醇、麦角甾醇过氧化物等20多种[5]，然而除麦角甾醇标准品较易获得外，其他标准物质均难以获得。甾醇类化合物的提取分离多以乙醇为提取原料，然后用氯仿萃取，再用NaOH水溶液萃取氯仿溶液，除去酸性部分，得到中性部分，然后用硅胶层析分离甾醇类化合物[6]或将中性部分在60～90 ℃条件下皂化，再经萃取，浓缩得到粗甾醇[7]，本文参考上述甾醇提取方法对破壁灵芝孢子粉进行样品制备，并以甾醇类物质为研究对象，系统地建立了破壁灵芝孢子粉的HPLC/DAD指纹图谱，同时将HPLC色谱法和生物细胞模型技术相结合，运用多元线性回归方法，考察破壁灵芝孢子粉粗甾醇提取物HPLC指纹图谱与抗人恶性乳腺癌细胞(MT-1)活性的相关性，通过“谱效”[8-9]关系筛选出能表征破壁灵芝孢子粉功效性的特征指纹图谱，以有效地控制破壁灵芝孢子粉质量。

1　材料与方法

1.1材料

灵芝孢子粉样品来自全国5个省份的不同生产厂家，具体见表1。经低温物理破壁后过80目筛制成破壁灵芝孢子粉。

表1　破壁灵芝孢子粉样品来源

1.2主要仪器和试剂

Agilent1200高效液相色谱仪(配备二极管阵列检测器),由美国安捷伦公司生产；AgilentZOBAXEclipseXDB-C18(250mm×4.6mm,5μm)不锈钢柱；AUY220型岛津分析天平；法国MilliporeMilli-QA10超纯水净化系统。

麦角甾醇对照品购自Sigma公司；甲醇(色谱纯)由美国fisher公司生产。RPMIMedium1640basic(1640培养基)、0.25%EDTA胰酶消化液，由美国gibco公司生产；PBS(1*)、青链霉素溶液(100*)由吉诺生物医药技术有限公司生产；培养皿和培养板由德国Greiner公司生产；HighPurePCRTemplatePreparationKit由Roche公司生产；Caspase-3/CPP32ActivityColorimetricAssayKit由美国BioVision公司生产。

1.3方法

1.3.1标准品和样品溶液的制备精密称取麦角甾醇10mg于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，备用。

取样品100g，加入20倍体积的95%乙醇90 ℃回流提取2h，重复2次。提取液浓缩成浸膏，将浸膏悬浮于热水中，用氯仿萃取3次。氯仿层加入2%NaOH溶液萃取，重复若干次。收集氯仿层的中性部分。中性部分加入1mol/LKOH乙醇液80 ℃下皂化1h，冷却后以正己烷萃取，得总甾醇部分，备用。

1.3.2HPLC指纹图谱的建立

1.3.2.1色谱条件色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；流速1.0mL/min；检测波长210nm，进样体积20μL；柱温30 ℃。流动相A：甲醇，流动相B：超纯水。梯度洗脱程序：0min(40%A)→15min(90%A)→25min(100%A)→45min(100%A)。

1.3.2.2方法学考察稳定性试验：取1号样品溶液于0、4、8、12、24h测定，考察方法的稳定性。

精密度试验：取1号样品溶液，连续进样5次，记录色谱图，考察方法的精密度。

重现性试验：取1号样品，按1.3.1的方法平行制备供试液5份，记录5份样品的色谱图，考察方法的重现性。

1.3.2.3HPLC指纹图谱的构建按照1.3.1的方法制备10批不同来源的破壁灵芝孢子粉供试液，记录HPLC色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件，将10批破壁灵芝孢子粉样品色谱图以AIA格式导入，以1号为参照图谱，设定时间窗宽度为0.1min，进行峰谱自动匹配。以平均数法作为标准图谱的生成方法。

1.3.2.4指纹图谱的评价以指纹图谱中峰面积最大的峰为参照峰，以参照峰的保留时间和峰面积作为1，分别计算10批样品共有指纹图谱的相对保留时间和相对峰面积。用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件计算指纹图谱的相似度。

1.3.2.5特征波长选择及特征峰定性按1.3.2.1色谱条件，分别尝试210、283、360nm的检测波长，取麦角甾醇标准品溶液上HPLC分析。通过保留时间的比对，确定样品色谱图中麦角甾醇特征峰。

1.3.3“谱效”关系的研究

1.3.3.1抗肿瘤活性参数IC50的测定取对数生长期人恶性乳腺癌细胞(MT-1)，计数后细胞均匀铺于96孔板中，细胞数为1×104个/孔。将培养板置于CO2培养箱中培养，待其贴壁后，取经1.3.1方法制备的各样品粗甾醇提取物分别以浓度80、100、120、140、160μg/mL给药，5个平行。培养24h后，镜检发现，浓度间有明显差异，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL，即0.5%MTT)，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入100μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD492nm处测量各孔的吸光值。绘制浓度-抑制率曲线得到IC50。

1.3.3.2“谱效”关系分析测定各样品色谱峰峰面积，与同类峰面积最大值相除，得到标准化峰面积比值，作为自变量，以抗人恶性乳腺癌细胞活性IC50作为因变量，利用SPSS16.0软件进行多元线性回归分析。

2　结果与分析

2.1破壁灵芝孢子粉指纹图谱建立

按1.3.1和1.3.2.1方法制备及测定样品，对10批不同来源的破壁灵芝孢子粉粗甾醇提取物进行测定，记录45min色谱图，通过比较各色谱图，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，对其进行自动校正，生成匹配谱图(图1)。

图1　破壁灵芝孢子粉标准指纹图谱

2.2方法学考察

在0、4、8、12、24h测定1号供试品溶液的色谱图，各主要色谱峰相对保留时间RSD小于1.0%，相对峰面积的RSD为1.2%～2.0%。1号供试品溶液连续进样5次，色谱图的各主要色谱峰相对保留时间RSD为0.3%～0.8%，相对峰面积的RSD为0.8%～1.5%，平行制备1号样品5份，其色谱图相对保留时间RSD为0.4%～0.8%，相对峰面积的RSD为1.6%～3.0%。结果表明，该方法稳定性、精密度、重现性良好。

2.3破壁灵芝孢子粉指纹图谱评价

以指纹图谱中峰面积较大的8号峰为参照物峰，以参照物峰的保留时间和峰面积作为1，分别计算10批样品共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，10批样品共有指纹峰的相对保留时间RSD小于1.0%，而相对峰面积RSD较大。

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件进行破壁灵芝孢子粉HPLC/DAD指纹图谱相似度计算，结果见表2。10批破壁灵芝孢子粉样品与对照图谱的相似度均在0.9以上，符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》[10]的要求，说明建立指纹图谱研究对象可信。

表2　10批破壁灵芝孢子粉样品相似度计算结果

2.4特征波长的选择与特征峰定性

根据指纹峰最多的选定原则[11]，经波长210、283、360nm测定后发现，在波长210nm下得到的响应最多(图2)。同时，麦角甾醇在210nm和283nm均有响应，经保留时间比对，确定出峰时间为29.749min的色谱峰(14号峰)为麦角甾醇峰。因此，选定210nm为指纹图谱测定波长。

图2　不同检测波长下破壁灵芝孢子粉指纹图谱

2.5各样品抗肿瘤活性参数IC50分析

按1.3.3.1方法，以人恶性乳腺癌细胞(MT-1)为功效评价对象，测定各破壁灵芝孢子粉样品粗甾醇提取物的抗肿瘤活性，结果见表3。IC50分别为：81.35、80.93、131.49、115.20、101.19、120.17、115.31、128.89、121.44、>160μg/mL。

表3　各样品不同给药浓度下抗人恶性乳腺癌细胞活性抑制率 %

2.6“谱效”关系分析

测定10批不同产地破壁灵芝孢子粉指纹图谱中的色谱峰A1～A15的峰面积，与同类峰面积最大值相处，得到标准化峰面积比值，作为自变量，以抗人恶性乳腺癌细胞活性IC50作为因变量，利用SPSS16.0软件进行多元线性回归分析，结果有1号、3号、4号、6号、8号、9号、11号、13号、14号等9个色谱峰被引入回归方程，得到回归方程为：

Y=0.976X1+0.740X3-0.285X4+1.011X6+1.219X8+0.782X9-1.510X11-0.014X13+1.407X14

此方程显示，X1、X3、X6、X8、X9、X14所代表的1号、3号、6号、8号、9号、14号色谱峰与抗人恶性乳腺癌细胞活性呈正相关，抗人恶性乳腺癌细胞活性能力随指纹图谱的1号、3号、6号、8号、9号、14号色谱峰强度增大而增大，其中14号峰为麦角甾醇，已被证实具有抗肿瘤作用[12-13]。其余色谱峰具体成分与结构尚待进一步研究证实。因此，本文确定1号、3号、6号、8号、9号、14号为特征性色谱峰。

3　小结与讨论

本文按照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》[8]的要求，建立破壁灵芝孢子粉甾醇类HPLC指纹图谱的分析方法，得到15个共有峰，稳定性、精密度、重现性良好，符合方法学要求；并对10批样品的相似度进行了考察，生成破壁灵芝孢子粉标准指纹图谱，各样品图谱与对照指纹图谱的相似度均在0.9以上。研究了各样品中15个共有峰的峰面积含量，并得到了粗甾醇提取物对人恶性乳腺癌细胞浓度-抑制率曲线及其参数IC50，两者经多元线性回归，进行“谱效”关系研究，明确了破壁灵芝孢子粉指纹图谱共有峰与抗人恶性乳腺癌细胞活性的相关性，证实了破壁灵芝孢子粉中麦角甾醇等6个色谱峰所代表化合物的含量高低可能影响其活性，将常规化学检定与生物检定相结合进行“谱效”关系研究，为破壁灵芝孢子粉的生产及质量控制提供了有效方法。

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(责任编辑:曾小军)

ConstructionofHPLCFingerprintsofSterolsinBrokenGanoderma lucidumSporesandRelationshipsbetweenTheirFingerprintandAntitumorActivity

JIANWei-ming,LIUXiao-hui,LIANGHui-jia,LIJie-yi,JIAOChun-wei

(GuangdongYueweiEdibleFungiTechnologyCompanyLimited,Guangzhou510663,China)

AmethodfortheanalysisofHPLCfingerprintsofsterolsinbrokenGanoderma lucidumsporeswasconstructed.TheHPLCfingerprintsof10batchesofbrokenGanoderma lucidumsporesamplesfromdifferentproducingareaswerecollected,andastandardfingerprintofbrokenGanoderma lucidumsporeswasconstructedbyusingthesoftware“SimilarityevaluationsystemoftraditionalChinesemedicinechromatographicfingerprints(2004edition)”.Theinhibitionratecurveandhalfeffectivedose(IC50)ofcoarsesterolextractfrom10batchesofsamplesagainsthumanmalignantbreastcancercells(MT-1)wereacquiredbyusingbiologicalcellmodeltechnique.TherelationshipbetweentheantitumoractivityparameterIC50andthestandardizedpeakarearatioofcommonpeaksfromHPLCfingerprintswasanalyzedbyusingmultiplelinearregressionstatistics.Theresultsindicatedthat:thestability,accuracyandreproducibilityofthismethodconformedtothedemandsofmethodology;fifteencommonpeakswereobtainedfromtheconstructedHPLCfingerprintsofsterols;thesimilaritiesbetweenthefingerprintsofvarioussamplesandthestandardfingerprintwereallabove0.9.ThestatisticalanalysisofIC50revealedthatthepeakNo. 1,No. 3,No. 6,No. 8,No. 9andNo. 14infingerprintshadclosecorrelationswiththeantitumoractivity,namelyergosterolandother5constituentswerethemainactivecomponentsofsterolsinbrokenGanoderma lucidumspores.

BrokenGanoderma lucidumspores;Sterols;Highperformanceliquidchromatography(HPLC);Fingerprint;Antitumoractivity;Fingerprint-effectrelationship

2016-01-22

广东省科技计划项目(2012B020316008)。

简伟明(1985─)，女，助理工程师，研究方向：食药用菌的质量控制。

S567.31

A

1001-8581(2016)08-0061-05