隐丹参酮抑制恶性神经胶质瘤细胞C6增殖及对JAK2-STAT3信号通路的影响

唐焕焕，沈晓燕，段小群，徐　庆，苑　博，张嫦丽，吕　良

隐丹参酮抑制恶性神经胶质瘤细胞C6增殖及对JAK2-STAT3信号通路的影响

唐焕焕1，沈晓燕2，段小群1，徐庆1，苑博1，张嫦丽1，吕良1

目的 评估隐丹参酮对恶性神经胶质瘤细胞C6的增殖作用及对JAK2-STAT3信号通路的影响。方法 使用MTT法评价隐丹参酮对C6细胞存活率的影响，使用hochest染色和BrdU插入法检测隐丹参酮对C6细胞凋亡和增殖的影响，使用Western blot法检测隐丹参酮对C6细胞p-JAK2和p-STAT3（Tyr705）的影响。结果 隐丹参酮显著抑制C6的生长和增殖（P＜0.05），但不促进凋亡。隐丹参酮显著抑制p-STAT3（Tyr705）蛋白表达，但不影响p-JAK2。结论 隐丹参酮是恶性神经胶质瘤C6的抗增殖剂，其作用机制与抑制STAT3信号有关。

恶性神经胶质瘤；增殖；JAK2-STAT3信号通路

网络出版时间：2016-5-9 15：43：10 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.004.html

恶性神经胶质瘤是原发性脑肿瘤中最常见的恶性肿瘤，并具有高死亡率［1］。恶性神经胶质瘤的经典治疗方法包括手术切除、术后放射治疗和化疗（通常用替莫唑胺）。但是，基于这些疗法，患者平均存活时间仅为14.6个月，并且，在过去的二十年中，患者的存活率并没有显著改善［2］。因此，为了提高神经胶质瘤的治疗的效果，探索更有效的治疗方法很有必要。隐丹参酮（cryptotanshinone），从丹参中提取分离得到的主要活性成分之一，已经报道具有广泛的药理作用。研究［3］显示隐丹参酮可以减轻氧化低密度脂蛋白诱导的动脉粥样硬化病灶的事件，并减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。隐丹参酮通过抑制RAW264.7细胞NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导途径抑制炎性细胞因子的分泌［4］。同时，隐丹参酮通过调节淀粉样前体蛋白的代谢产生神经保护和抗阿尔茨海默病的作用［5］。研究［6-9］显示，隐丹参酮具有抗肿瘤的活性。该研究旨在研究隐丹参酮对恶性神经胶质瘤细胞C6的抗肿瘤作用，并探索其作用机制。

1　材料与方法

1.1主要仪器与试剂 荧光倒置显微镜购自日本NIKON公司产品；CO2培养箱购自美国Thermo公司产品；酶标仪购自美国Bio-Tech公司；C6细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；DMEM、青霉素链霉素双抗（PS）、胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司；隐丹参酮、MTT、DMSO购自美国Sigma Aldrich公司；BrdU细胞增殖试验盒购自美国Exalpha Biologicals公司；抗p-STAT3（Tyr705）和抗p-JAK2抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；抗GAPDH抗体、hochest33258购自苏州碧云天公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 C6细胞用高葡萄糖DMEM培养基，含10%FBS、100 μg/ml链霉素和100 U/ml的青霉素，在37℃、5%CO2培养箱中培养。每周1次的间隔，以1∶5的比例进行传代培养。

1.2.2MTT法 为了测量细胞生长，进行MTT测定法。细胞铺在100 μl 96孔板的培养基中。培养过夜后，将细胞用各种浓度的CTS的处理24～48 h，然后用MTT（5 mg/ml）孵育和DMSO（100 μl/孔）溶解。用酶标仪测定570 nm处的吸光度值。

1.2.3hochest33258法染色细胞 细胞接种于培养板，不同浓度隐丹参酮处理24 h后，弃去培养液，用PBS洗3次，4%多聚甲醛常温下固定30 min，PBS洗3次，5 mg/L Hoechst 33258常规染色10 min，PBS洗3次，倒置荧光显微镜下观察。

1.2.4BrdU细胞增殖试验 参考文献［10］报道和BrdU细胞增殖测定试剂盒说明，对细胞增殖进行测定。简言之，将细胞悬浮在生长培养基中接种在96孔板中，密度为每个孔10 000个细胞，并在5%的CO2培养箱37℃培养过夜。第2天加入0～20 μmol/L浓度的隐丹参酮。隐丹参酮处理48 h后，20 μl的BrdU加入到每个孔，孵育12 h。然后加入固定液在室温中培养30 min。洗涤后，细胞与一个预稀释的检测抗体在室温下孵育1 h。加入HRP偶联的二抗在室温下孵育1 h后，加入终止液。然后用酶标仪在450 nm测定光密度值。

图1　不同浓度隐丹参酮对C6细胞形态的影响 ×100A：隐丹参酮（0 μmol/L）处理组；B：隐丹参酮（2.5 μmol/L）处理组；C：隐丹参酮（5 μmol/L）处理组；D：隐丹参酮（10 μmol/L）处理组；E：隐丹参酮（20 μmol/L）处理组

1.2.5Western blot法检测 各组细胞用预冷的PBS洗涤2次，用RIPA缓冲液［含50 mmol/L的Tris，pH 7.4，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L的PMSF，1 mmol/L的EDTA，1%的Triton X-100，0.1%十二烷基硫酸钠（SDS），1 mmol/L的Na3VO4，1 mmol/L的NaF和蛋白酶抑制剂混合物（罗氏公司）］收集蛋白样品。含等量蛋白的样品通过SDS-PAGE凝胶电泳分离，并转移至硝酸纤维素膜上。膜在含0.05% Tween-20的PBS中用5%脱脂牛奶封闭1 h，然后在4℃中用一抗孵育过夜。然后将膜用PBS洗涤后，用辣根过氧化物酶连接的二抗在室温孵育1 h。条带通过增强型化学发光液进行免疫发光并进行检测，用化学发光成像仪观察。

2　结果

2.1从细胞形态角度观察隐丹参酮对C6细胞生长的影响 加不同浓度隐丹参酮后，在显微镜下观察细胞的密度、形态，见图1，随着隐丹参酮浓度的增加，细胞密度减少。

2.2采用MTT法检测隐丹参酮对C6细胞生长的影响 各组间差异有统计学意义（F=100.87，P＜0.05），隐丹参酮呈浓度依赖性抑制C6细胞生长。见图2。

2.3使用BrdU掺入测定法确认CTS对细胞增殖的效果 各组间差异有统计学意义（F=48.08，P＜0.05），隐丹参酮剂量依赖性抑制C6细胞增殖。见图3。

图2　隐丹参酮对C6细胞存活率的影响与隐丹参酮0 μmol/L组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

图3　隐丹参酮对C6细胞增殖率的影响与隐丹参酮0 μmol/L组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

2.4采用hochest33258法检测隐丹参酮对C6细胞凋亡的影响 不同剂量隐丹参酮（0～20 μmol/ L）处理24 h后细胞核呈现弥漫均匀的低强度荧光，呈浅染核大形态，均未出现核碎裂、核固缩等典型细胞凋亡形态。见图4。

2.5Western blot法检测隐丹参酮对激活状态的STAT3的作用 STAT3信号通路在肿瘤生长中有关键作用，STAT3信号通路在人脑胶质瘤细胞呈持续激活状态。本实验研究隐丹参酮是否对激活状态的STAT3具有作用。隐丹参酮（5、10 μmol/L）对C6细胞Tyr705位点磷酸化具有抑制作用。为了探索隐丹参酮是否通过抑制STAT3上游信号通路引起的其磷酸化水平的变化，本研究检测STAT3的上游激酶JAK2的磷酸化水平。隐丹参酮（5、10 μmol/L）处理1 h后，使用Western blot法检测p-JAK2、p-STAT3（Tyr705）和GAPDH蛋白表达水平，结果显示隐丹参酮并不影响上游激酶JAK2的磷酸化水平，见图5。

图4　不同浓度隐丹参酮对C6细胞核hochest33258染色的影响 ×100A：隐丹参酮（0 μmol/L）处理组；B：隐丹参酮（2.5 μmol/L）处理组；C：隐丹参酮（5 μmol/L）处理组；D：隐丹参酮（10 μmol/L）处理组；E：隐丹参酮（20 μmol/L）处理组

图5　不同浓度隐丹参酮对C6细胞p-JAK2和p-STAT3（Tyr705）的影响

3　讨论

本实验研究了隐丹参酮对神经胶质瘤细胞株C6的增殖作用，并探讨其可能机制。结果表明：①隐丹参酮具有抑制神经胶质瘤细胞株C6生长的作用；②隐丹参酮抑制神经胶质瘤细胞株C6的生长是通过抑制细胞增殖途径，而不是凋亡；③隐丹参酮抑制p-STAT3（Tyr705），但不抑制其上游激酶JAK2。

前期研究［11］中用隐丹参酮处理正常大鼠脑细胞（原代皮层神经元和星形胶质细胞）显示，在2.5～20 μmol/L浓度范围内隐丹参酮对正常细胞没有毒性。因此本研究使用了上述浓度进行大鼠来源的恶性胶质瘤细胞株C6的抗肿瘤实验。隐丹参酮对其它类型肿瘤的作用已有部分报道［6-9］，在HepG2和MCF7肿瘤细胞，隐丹参酮通过诱导细胞凋亡抑制细胞生长。在前列腺癌、白血病和宫颈癌细胞株，隐丹参酮既诱导细胞凋亡，又抑制其增殖，从而抑制肿瘤细胞生长［6-9］。研究显示隐丹参酮抑制神经胶质瘤细胞的生长作用是通过增殖途径，且没有证据表明隐丹参酮会诱导神经胶质瘤细胞凋亡。而在恶性神经胶质瘤细胞STAT3是持续性激活的，这与正常细胞不同［12］。因此，特异性靶向STAT3信号的被认为是治疗恶性神经胶质瘤的具有潜在开发价值的靶点［13］。

已经有文献［14］报道，隐丹参酮不会影响上游激酶的磷酸化水平，如EGFR和Src。因此，本研究选择检测这些生长因子和细胞因子受体的下游激酶（JAK2），而这些激酶在胶质瘤中是异常激活的。遗憾的是，并没有显示隐丹参酮对p-JAK2具有改变作用。虽然最近的研究［10］表明，CTS通过抑制mTOR信号抑制Rh30和DU145细胞的增殖。并且，在C5a诱导的RAW264.7细胞的迁移实验中，隐丹参酮抑制p-Akt［15］。因此在不同细胞类型中隐丹参酮可能具有不同的作用和机制。可以确认CTS选择性阻断STAT3的酪氨酸磷酸化。

综上所述，当前的研究表明，CTS可能是一个潜在的神经胶质瘤抗增殖剂，其机制可能与STAT3信号有关。

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Cryptotanshinone inhibits proliferation of malignant glioma C6 cells and its influence on JAK2-STAT3 signal pathway

Tang Huanhuan1，Shen Xiaoyan2，Duan Xiaoqun1，et al
（1Dept of Pharmacology，Guilin Medical University of Pharmacy，Guangxi 541001；2Dept of Pharmacology and Biochemistry，Fudan University of Pharmacy，Shanghai 200120）

Objective To evaluate the effect of cryptotanshinone（CTS）on the proliferation of malignant glioma C6 cells and its influence on JAK2-STAT3 signal pathway.Methods MTT was used to evaluate the survival rate of CTS on C6 cells.Hochest staining and BrdU assay was used to detect the cell apoptosis and proliferation.Western blot was used to detect the expressions of p-JAK2 and p-STAT3（Tyr705）.Results CTS inhibited C6 cells growth and proliferation significantly（P＜0.05），but not induced apoptosis.CTS decreased phosphorylation of p-STAT3（Tyr705），but not p-JAK2.Conclusion CTS may be a potential anti-proliferation agent of malignant glioma C6 cells and that its mechanism may be related to the inhibition of STAT3 signaling.

malignant glioma；proliferation；JAK2-STAT3 signaling pathway

R 966

A

1000-1492（2016）06-0769-04

2016-03-04接收

国家自然科学基金（编号：81460619）；广西自然科学基金青年项目（编号：2015GXNSFBA139178）

1桂林医学院药学院药理学教研室，桂林 5410012复旦大学药学院药理学与生物化学教研室，上海200120

唐焕焕，女，硕士研究生；吕 良，男，讲师，硕士生导师，责任作者，E-mail：luliang998@163.com