山东半岛北岸不同生境潮间带浮游细菌多样性研究

王恩辉, 张晓黎, 张 莹, 龚 骏, 刘东艳, 王玉珏



山东半岛北岸不同生境潮间带浮游细菌多样性研究

王恩辉1, 2, 张晓黎1, 张 莹1, 2, 龚 骏1, 刘东艳1, 王玉珏1

(1. 中国科学院 烟台海岸带研究所 海岸带环境过程与生态修复重点实验室, 山东 烟台 264003; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

通过提取山东半岛北岸不同类型潮间带海水样品的总DNA, 构建16S rDNA文库, 利用群落相似性分析(ANOSIM)和非度量多维尺度转换排序(NMDS), 探究潮间带类型对浮游细菌群落结构的影响, 并对比了与近海浮游细菌群落结构的差异。分析结果显示, 浮游细菌的丰度及多样性受到潮间带类型的影响, 烟台养马岛泥滩、石滩、辛安河沙滩、黄河三角洲碱蓬区和天鹅湖海草区以变形菌门占优势, 而黄河三角洲米草区以拟杆菌门为优势菌, 其中, 天鹅湖海草区浮游细菌的丰富度和多样性最高。潮间带海水中浮游细菌的组成与近海存在显著差异, 潮间带浮游细菌的丰度及多样性均显著高于近海。推测季节因素、植被类型、有机质来源可能是造成潮间带不同生境与近海浮游细菌多样性差异的重要因素。

潮间带; 浮游细菌; 多样性; 核糖体DNA

潮间带生境复杂, 生物多样性高, 包括泥滩、沙滩、岩石滩、石沼、红树林、海草床等不同类型生态系统。海洋细菌在生态系统的物质循环与能量流动中发挥重要作用[1-3]。已有的一些研究发现, 潮间带细菌群落结构与环境中溶解氧、粒度、pH、温度、营养盐浓度密切相关[4-6]; 且潮间带的植被类型与生长状况亦影响到细菌群落结构[7-8]。比较而言, 植被群落对潮间带浮游细菌群落结构影响的研究相对较少, 且浮游细菌群落组成与潮间带生境类型的关系还不甚清楚。因此, 本研究选择山东半岛北岸的泥滩、沙滩、岩石滩、盐碱植被覆盖区、海草床等多种潮间带类型, 利用细菌16S rDNA克隆文库及测序等方法, 开展了潮间带不同生境浮游细菌多样性特征及群落结构的比较研究, 探究植被覆盖是否能对潮间带浮游细菌群落结构产生显著影响。研究结果对进一步了解植被群落对海岸带细菌分布的影响规律及潮间带生态系统功能多样性提供基础数据。

1 材料方法

1.1 研究地点概况与样品采集

山东半岛潮间带生境类型多样, 包括泥滩、沙滩、岩石滩、碱蓬区、米草区、海草区、礁石区等。本次样品采集于2014年7月山东半岛北岸潮间带及烟台近海区域, 具体样点见图1, 分别位于养马岛石滩区(HI-R)、泥滩区(HI-M), 辛安河沙滩区(XR-S), 黄河三角洲碱蓬区(YRD-SU)、米草区(YDU-SM); 天鹅湖海草区(SL)以及月亮湾近海(MBO)七个位点。养马岛石滩区(HI-R)位于烟台养马岛东南部, 生境内多礁石, 分布有小型排污口并紧临酒店及生活区, 海水受污水排放影响; 泥滩区(HI-M)位于养马岛西南部, 底质为泥质, 水体较洁净; 辛安河沙滩(XR-S)位于辛安河河口, 底质为细砂, 附近虽然分布有扇贝加工厂及污水处理厂, 但排污口向近海方向延伸较长; 黄河三角洲碱蓬区 (YRD-SU)和米草区(YDU-SM)受人类活动影响较少,植被覆盖度较高; 海草区(SL)位于天鹅湖自然保护区内, 海水洁净, 生物多样性较高; 月亮湾近海区(MBO)为旅游区, 受人类活动影响频繁。于各生境大潮时前后2天内到采样区域进行样品采集, 在低潮时利用灭菌采集瓶随机采集3份表层海水样品各1 L, 所采集的海水样品受下层悬浮物影响较小, 并乘船至月亮湾近海用相同方法采集3份表层海水样品。将3份重复样品经200 μm孔径筛绢去除大型藻类和其它杂质, 分别过滤到0.22 μm孔径的醋酸纤维脂膜上, 膜样液氮保存, 用于后续的分子生物学实验。

1.2 基因组DNA的提取与PCR扩增

利用FastDNA®Spin Kit核酸提取试剂盒(MP Bio, USA)提取膜样总DNA, 利用微量紫外分光光度计Nanodrop 2000C(Thermo, USA)检测DNA的浓度和纯度。采用细菌16SrDNA通用引物341F (5-CCTACGGGAGGCAGC-3′)和907R(5′-CCGTCA ATTCCTTTG-3′)进行PCR扩增。25 μL扩增体系为: 5×Buffer 5 μL, dNTPs 0.5 μL, Primer 341F 1 μL, Primer 907R 1 μL, 水16.15 μL, Taq酶0.25 μL, 模板DNA 1 μL。PCR扩增条件为: 94预变性5 min; 94变性30 s, 53退火30 s, 72延伸60 s, 循环30次; 最后72延伸8 min。

1.3 细菌克隆文库构建及基因序列分析

将每个位点3个重复的PCR扩增产物合并, 经琼脂糖凝胶电泳检测, 利用胶纯化试剂盒(天根, 中国)纯化后, 连接到PTZ57R/T1克隆载体(Ins Taclone PCR Cloning kit, USA)上, 然后转化到大肠杆菌()DH5α感受态细胞中。将菌液均匀涂布平板, 通过蓝白斑筛选, 每个位点样品挑取约100个克隆子, 利用通用引物M13F/M13R进行PCR扩增, 电泳检测剔除假阳性, 阳性克隆被送至上海生工测序公司测序。

测序获得的序列利用BioEdit软件去除载体序列后, 选取长度为500~600 bp的序列上传至DECIPHER (Database Enabled Code for Ideal Probe Employing R)网站, 利用在线检测工具Find Chimera检测嵌合体[9]。去除嵌合体序列后, 将剩余序列上传至RDPⅡ (Ribosomal Database Project II)网站, 利用RDP Pipeline在线Aligner功能对序列进行, 其结果直接利用在线Clust功能确定分类单位(Operation Taxonomic Unit, OTU),序列差异水平为0.03。Clust结果经RDP Analyse Tools计算Chao1及Shannon指数, 并计算各样品的Rarefaction数据[10], 数据结果利用Original 8.0绘图软件绘制各样品的稀疏曲线。同时利用公式=[1–(/)]*100%计算克隆文库覆盖率, 其中为只出现一次的克隆子数目,是文库中筛选出来的总的阳性序列数目。

将所获的16SrDNA序列上传至NCBI GenBank数据库, 登录号为:

KR077181-KR077236; KR077242-KR077247; KR077249-KR077311; KR077313-KR077322; KR077324-KR077326; KR077330-KR077334; KR077337-KR077379; KR077382-KR077385; KR077390-KR077415; KR077417-KR077461; KR077464-KR077469; KR077471-KR077474; KR077476-KR077563; KR077565-KR077704; KR077715-KR077726; KR077736-KR077738; KR077741-KR077756; KR077759-KR077762。

1.4 微生物群落结构分析

将去除嵌合体后的序列利用RDP Pipeline在线Classified功能, 确定不同生境中微生物的系统发育地位, 计算每条序列在不同分类水平上分配到此rank中的概率值, 大于0.8说明到该分类水平的结果可信[11]。同时利用RDP Pipeline的Formats For Common Progress功能将Clust分类结果转化, 导出各样品中OTU分类单元的分布情况, 同时将统计数据导入PRIMER 6.0软件中, 通过对数据进行log(+1)转化, 并利用Bray–Curtis群落相似系数对样品进行两两比较将数据转换成矩阵形式, 通过非计量多维尺度转换排序(NMDS)工具对所有位点浮游细菌群落结构进行排序, 同时利用软件包中的ANOSIM 检验分析植被覆盖对潮间带浮游细菌群落结构的影响。NMDS分析的可信性通过Kruskal应力系数来计算。应力系数介于0~0.025之间说明拟合度非常好, 介于0.025~0.05之间说明拟合度好, 介于0.05~0.1之间说明拟合度较好。当应力系数大于0.2说明拟合结果较差。

2 结果

2.1 潮间带不同生境及近海浮游细菌丰富度和多样性比较

测序所得序列经嵌合体去除, 共获得534条高质量序列, 每个样品获得59~91条序列。在0.03的阈值设定下, 共获得134个OTU, 每个样品获得18~45个OTU(表1)。从图2上看, 大部分样品的稀疏曲线已经趋于平缓, 虽然有些样品的稀疏曲线还在上升, 但各克隆文库覆盖率均大于70%(表1), 说明克隆文库的筛选与测序已涵盖了大部分细菌类群。近海样品的Chao1与Shannon指数均低于潮间带样品; 在不同生境的潮间带样品中, 天鹅湖海草区的多样性指数最高(Chao1=111.4; Shannon=3.48), 而新安河沙滩区细菌丰富度最低, 但其多样性指数相对较高(Chao1=52.55; Shannon=3.21), 养马岛岩石区细菌多样性指数最低, 但其丰富度较高(Chao1= 62.3; Shannon=2.07)(表1)。