微波辅助衍生-液相色谱-串联质谱法快速测定养殖水体中5种硝基呋喃类代谢物残留

尹　怡，张宏峰，刘书贵，郑光明，朱新平，彭荣飞，单　奇

(1.中国水产科学研究院，珠江水产研究所/农业部热带亚热带水产种质资源利用与养殖重点实验室/农业部水产品质量安全风险评估实验室(广州)， 广东 广州　510380；2.广州市疾病预防控制中心，广东 广州　510440)



微波辅助衍生-液相色谱-串联质谱法快速测定养殖水体中5种硝基呋喃类代谢物残留

尹怡1，张宏峰2，刘书贵1，郑光明1，朱新平1，彭荣飞2，单奇1

(1.中国水产科学研究院，珠江水产研究所/农业部热带亚热带水产种质资源利用与养殖重点实验室/农业部水产品质量安全风险评估实验室(广州)， 广东 广州510380；2.广州市疾病预防控制中心，广东 广州510440)

建立了微波辅助衍生结合液相色谱-串联质谱(MAD-LC-MS/MS)同时测定水产养殖用水中硝基呋喃类代谢物3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)、1-氨基-2-丙酰脲(AHD)和3,5-二硝基水杨酸肼(DNSAH)的分析方法。样品经2-硝基苯甲醛微波辅助衍生1 min，乙酸乙酯提取，Acquity UPLC BEH C18色谱柱分离，以乙腈-乙酸铵(5 mmol/L,0.1%甲酸)溶液为流动相，梯度洗脱，电喷雾正负离子切换模式电离，多反应监测模式(MRM)测定。结果表明：5种代谢物在0.2～50 μg/L范围内线性关系良好，相关系数均大于0.997，方法的定量限为0.02～0.05 μg/L；在0.1～5 μg/L的3个添加水平下，回收率在79%～102%之间，相对标准偏差(RSD)在3.6%～10.1%之间。该方法快速、简便，且易于推广，可以同时监测养殖水体中5种硝基呋喃代谢物的残留。

硝基呋喃代谢物；微波辅助衍生；液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)；养殖水体

硝基呋喃类药物(Nitrofurans)是一类人工合成的，具有5-硝基呋喃基本结构的广谱抗菌药物，主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和硝呋索尔等。这类药物具有抑菌和杀菌功效，曾广泛用于防治水产动物疾病。但硝基呋喃类药物在动物体内代谢迅速，其代谢产物具有遗传毒性、诱变性和致癌性[1]，欧盟[2]、美国[3]、日本[4]等国家相继发文禁止其在动物源性食品中使用，我国也于2002年规定水产养殖中禁止使用该类药物[5]。尽管如此，由于硝基呋喃类药物的价格低廉且药效显著，在水产养殖中仍常有违法使用的情况，导致养殖环境用水被污染。因此，有必要建立水体中硝基呋喃代谢物的快速检测方法，准确地检测该类药物在水体中的残留量，从而反映水体被污染的状况。

硝基呋喃代谢物的相对分子质量较小，直接检测时质谱的背景噪音大、灵敏度低。传统的衍生方法有烘箱加热或水浴加热，以及目前报道的恒温振荡[6-9]，但该方法的衍生时间较长，为3～16 h。近年来，微波技术在提取、消解、有机合成和衍生等诸多领域得到了广泛应用。微波辅助衍生是利用微波介电加热，它不仅缩短了衍生时间，与恒温振荡衍生相比还可以得到相似或更高的衍生产率，目前已应用于糖[10]、氨基酸[11-12]、脂肪酸[13]、兽药[14-15]、三聚氰胺[16]和激素[17]等化合物的检测中。

本研究将微波辅助技术应用于衍生化，采用液相色谱-串联质谱正、负切换模式同时测定5种硝基呋喃代谢物，以期实现快速衍生，建立养殖水体中5种硝基呋喃代谢物的新型检测方法。

1　 实验部分

1.1主要仪器

Acquity UPLC，Xevo TQ MS高效液相色谱-串联质谱仪：美国Waters公司产品；旋涡混匀器：德国IKA公司产品；超纯水机：美国Millipore公司产品；离心机：上海飞鸽公司产品；氮吹仪：美国Organomation公司产品；微波炉：格兰仕公司产品；pH计：美国Thermo-Fisher公司产品。

1.2主要材料与试剂

甲醇、乙腈、乙酸乙酯：均为色谱纯，美国Honeywell公司产品；甲酸：色谱纯，日本TCI公司产品；二甲亚砜、乙酸铵：均为色谱纯，美国Sigma公司产品；2-硝基苯甲醛：纯度>98%，美国Alfa Aesar公司产品；正己烷、盐酸、氢氧化钠、磷酸氢二钾：均为分析纯；实验用水为超纯水。

3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)和5-甲基吗琳-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)标准品(纯度>99%)：德国Witega公司产品；氨基脲(SEM)和1-氨基-2-丙酰脲(AHD)标准品(纯度>99%)：德国Dr.Ehrenstorfer公司产品；3,5-二硝基水杨酸肼(DNSAH)标准品(纯度>93.0%)：英国LGC公司产品。5种硝基呋喃类药物及其代谢物的结构式示于图1。

图1　5种硝基呋喃类药物及其代谢物的结构式Fig.1　Structures of 5 nitrofurans and their metabolites

1.3标准溶液的配制

硝基呋喃代谢物标准贮备液(1.0 g/L)的配制：称取适量的硝基呋喃代谢物标准物质，用甲醇配制成1.0 g/L的标准贮备液，于-18 ℃避光贮存，6个月有效。

硝基呋喃代谢物混合标准工作液(1.0 mg/L)的配制：移取适量的硝基呋喃代谢物标准贮备液，用甲醇稀释成1.0 mg/L的混合标准工作溶液，于-18 ℃避光贮存，1个月有效。

2-NBA衍生剂的配制：准确称取112.5 mg 2-NBA，溶于15 mL二甲亚砜中，现配现用。

1.4实验条件

1.4.1色谱条件Acquity UPLC BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm×1.7 μm)；流动相：A为乙腈，B为乙酸铵缓冲溶液(5 mmol/L，0.1%甲酸)；流速0.35 mL/min；柱温40 ℃；进样体积5 μL；梯度洗脱：在3 min内乙腈由10%线性升至90%，保持2 min，柱平衡时间3 min。

1.4.2质谱条件大气压电喷雾离子源(ESI)，正负离子切换模式；电离电压2.0 kV；离子源温度150 ℃；锥孔气流速50 L/h；脱溶剂气温度450 ℃；脱溶剂气流速650 L/h；多反应监测(MRM)扫描模式。多反应监测母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量列于表1。

表1　多反应监测定性、定量离子对以及质谱相关参数

注：*表示定量离子

1.5样品处理

准确移取10.0 mL经滤纸过滤的水样于50 mL离心管中，加入浓HCl调至pH 3，振摇混匀后，加入200 μL 2-NBA溶液，涡旋混合30 s，旋松离心管盖，置于微波高档(700 W)条件下衍生反应1 min。

取出离心管冷却至室温，加入5 mL 0.1 mol/L KH2PO4溶液，用1 mol/L NaOH溶液调pH至7.0～7.5，加入10 mL乙酸乙酯，涡旋混合30 s，然后以4 000 r/min离心5 min；取上层液，40 ℃氮气吹干，残渣用1.0 mL流动相涡旋混合溶解，过0.22 μm滤膜后，上机测定。上述操作均在避光条件下完成。

2　结果与讨论

2.1色谱质谱条件的优化

取5 mL 1 mg/L的5种硝基呋喃代谢物混合标准工作液，按照1.5节方法处理，并定容至5 mL，然后将该溶液以流动注射的方式在正离子和负离子模式下进行母离子全扫描，以确定母离子。结果显示，3,5-二硝基水杨酸肼衍生物(NP-DNSAH)在负离子模式下有较强的分子离子峰，而其他4种衍生物均为在正离子模式下的母离子灵敏度较高。选定母离子后，对其子离子进行全扫描，选取丰度较强、干扰较小的两对子离子作为定性离子。优化碰撞能量、毛细管电压、锥孔电压等，使灵敏度达到最佳，优化后的质谱条件见1.4.2节。

采用BEH C18反相色谱柱对3-氨基-2-唑烷基酮衍生物(NP-AOZ)、1-氨基-2-丙酰脲衍生物(NP-AHD)、氨基脲衍生物(NP-SEM)、5-甲基吗琳-3-氨基-2-唑烷基酮衍生物(NP-AMOZ)和3,5-二硝基水杨酸肼衍生物(NP-DNSAH)进行分离，考察甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙酸铵、乙腈-乙酸铵甲醇-甲酸-乙酸铵和乙腈-甲酸-乙酸铵等流动相对5种待测组分峰形和灵敏度的影响。结果表明：添加乙酸铵溶液的流动相的峰形较好，且添加0.1%甲酸的乙酸铵溶液有助于待测组分的电离，能提高灵敏度且碎片离子比较稳定；而采用甲醇-乙酸铵溶液作为流动相时，NP-AMOZ容易受到干扰。因此，本实验选择乙腈-乙酸铵(5 mmol/L，0.1%甲酸)溶液作为流动相，优化后的谱图示于图2。

注：a.m/z 236/134;b.m/z 335/291;c.m/z 249/134;d.m/z 209/166;e.m/z 374/183图2　5种待测物标准溶液的提取离子色谱图Fig.2　Selected ion chromatograms of 5 standard solutions

2.2衍生时间的优化

准确移取0.05 mL，1 mg/L的5种硝基呋喃代谢物混合标准工作液，调节至pH 3，加入200 μL 2-NBA衍生化试剂，涡旋混合30 s，置于微波炉高档(700 W)条件下分别衍生0 s、10 s、30 s、1 min、2 min和5 min，其余操作按1.5节方法进行，然后上机测定，结果列于表2。由表2可知，衍生时间为1～2 min时，5种衍生物的峰面积最大，因此，选择衍生时间为1 min。

表2　不同衍生时间下，5种衍生物的峰面积(n=5)

2.3基质效应

采用液相色谱-串联质谱法进行药物残留检测时常出现基质效应，导致目标化合物发生离子增强或抑制作用，影响定量分析的准确度和精密度。基质效应的确认方法，即计算阴性基质匹配标准溶液与纯溶剂标准溶液响应值的比值。当比值接近1时，说明不存在基质效应的影响；当比值大于或小于1时，说明基质对待测组分的响应有增强或抑制效应[18]。但在实际检测中，相对比值在0.85～1.15之间则认为基质效应不明显[19]。本实验同时测定了浓度为0.2～50 μg/L的系列基质匹配校准工作溶液和流动相标准溶液，并分别绘制标准曲线，通过计算基质校准曲线斜率与流动相标准曲线斜率的差异来考察方法的基质效应。结果表明：5种衍生物斜率的相对比值都在0.85～1.15之间，说明基质效应不明显，可以不予考虑。因此，本实验用流动相溶解样品和配制标样。

2.4衍生方式的对比

由于5种硝基呋喃代谢物的相对分子质量较小，直接进样检测时，质谱背景噪音大，容易受低质量端离子干扰，灵敏度较低，无法准确定性和定量，而用2-NBA衍生5种代谢物可以形成具有较好特性的衍生物，使质谱检测灵敏度有较大的提高。生物体中残留的AOZ、AMOZ、AHD、SEM 和DNSAH是以结合态和游离态两种形式存在的，衍生条件为37 ℃下衍生16 h[6-7]；而水体中的硝基呋喃代谢物是以游离态形式存在的，衍生时间可降至8 h[9]。本实验对比了微波辅助衍生1 min和恒温振荡8 h两种方法对衍生物峰面积回收率和相对标准偏差(RSD)的影响，结果列于表3。从表3可以看出，这两种方法对衍生效果没有显著性差异，均能满足痕量分析的要求。

表3　微波辅助与恒温振荡衍生方法的对比(n=5)

2.5方法的线性范围、检出限和定量限

取适量的混合标准溶液，按1.5节步骤操作，使最终标准溶液的浓度分别为0.2、1、5、20和50 μg/L。以浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，绘制标准校准曲线，并做线性回归分析，5种待测组分在0.2～50 μg/L范围内的线性关系良好。

向空白水样中添加5种待测组分，以信噪比(S/N)为3计算最低检出限(LOD)，以S/N为10计算最低定量限(LOQ)。5种硝基呋喃代谢物的LOD为0.01～0.02 μg/L，LOQ为0.02～0.05 μg/L，其结果列于表4。

2.6回收率和精密度

用不含5种待测组分的水样进行加标回收率和精密度实验，按1.5节方法对样品进行前处理。选取浓度为0.1、1.0和5.0 μg/L硝基呋喃代谢物作为添加量，每个添加水平进行6次重复实验，其结果列于表5。从表5可知，样品中5种硝基呋喃代谢物的加标回收率在79%～102%之间，RSD(n=6)在3.6%～10.1%之间。实验说明本方法的准确度与精密度较好，能满足残留分析的要求。

2.7实际样品的测定

采用本方法对20个池塘的养殖水体进行检测，从其中3个水样中检出呋喃西林代谢物SEM，含量在0.12～0.86 μg/L之间。

表4　硝基呋喃代谢物的线性回归方程、检出限和定量限

表5　加标回收率与相对标准偏差(n=6)

3　结论

本研究建立了微波辅助衍生-液相色谱-串联质谱法检测养殖水体中5种硝基呋喃代谢物的残留量，方法的回收率为79%%～102%，相对标准偏差小于11%。该方法操作简单、快速，且易于推广，适用于养殖水体中硝基呋喃代谢物残留量的测定。

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Determination of Nitrofuran Metabolites in Fishery Water by Microwave Assisted Derivatization and Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

YIN Yi1, ZHANG Hong-feng2, LIU Shu-gui1, ZHENG Guang-ming1,ZHU Xin-ping1, PENG Rong-fei2, SHAN Qi1

(1.MinistryofAgriculture/MinistryofAgricultureLaboratoryofQuality&SafetyRiskAssessmentforAquaticProduct(Guangzhou),KeyLaboratoryofTropical&SubtropicalFisheryResourceApplication&Cultivation,PearlRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Guangzhou510380,China;2.PhysicalandChemicalLaboratory,GuangzhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Guangzhou510440,China)

A method based on microwave-assisted derivatization (MAD) with liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was developed for determination of 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ), 3-amino-5-morpholinomethy-2-oxazolidinone (AMOZ), semicarbazide (SEM), 1-aminohydantoin (AHD) and 3,5-dinitrosalicylic acid hydrazide (DNSAH) in fishery water. The sample was extracted with ethyl acetate, then was derivatized with 2-nitrobenzaldehyde using microwave assisted method for 1 min. The analysis was carried out on an Acquity UPLC BEH C18 column by gradient elution with acetonitrile-ammonium acetate (5 mmol/L, 0.1% formic acid) as mobile phase, and was detected by LC-MS/MS system with positive and negative electrospray ionization under multiple reaction monitoring (MRM) mode. The results show that the metabolites have good linearity in the range of 0.2-50 μg/L, and the correlation coefficients (R2) are better than 0.997. The limits of quantification (LOQs) of the five targets are in the range of 0.02-0.05 μg/L. The average recoveries range from 79% to 102% for the five targets at three spiked levels with the relative standard deviations of 3.6%-10.1%. The method is proved to be fast and effective for simultaneously qualitative and quantitative inspection of the metabolites of nitrofuran in fishery water.

nitrofuran metabolites; microwave assisted derivatization; liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); fishery water

2015-04-01;

2015-05-04

国家水产品质量安全风险评估项目(GJFP2015001)资助

尹怡(1982—)，女，湖南常德人，助理研究员，从事水产品质量安全与风险评估研究。E-mail: yin.yi@126.com

郑光明(1964—)，男，湖北仙桃人，研究员，从事水产品质量安全与风险评估研究。E-mail: zgmzyl1964@163.com

O657.63

A

1004-2997(2015)04-0106-08

10.7538/zpxb.youxian.2015.0047

网络出版时间：2015-09-09；网络出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20150909.1515.016.html