去甲金霉素添加金属离子工艺研究

李翠平,李爱玲,王振坤

(天方药业有限公司，河南 驻马店 463000)

去甲金霉素添加金属离子工艺研究

李翠平,李爱玲,王振坤

(天方药业有限公司，河南 驻马店 463000)

以金色链霉菌发酵制备去甲金霉素，在发酵过程中在不同时间添加不同浓度、不同种类的金属离子，通过摇瓶实验、小试实验选出了能提高去甲金霉素发酵生产的金属离子。通过12m3发酵罐的连续5批验证在48h添加0.02%的Co2+，使去甲金霉素发酵水平提高120.52%。

去甲金霉素；发酵；金属离子

在1957年由McCormick首先报导的去甲金霉素[1](Demethylchlortetracycline),又称地美环素、去甲氯四环素,其是一种四环类抗生素。金色链霉菌(Streptmyces sureofaciens)染色体上的阅读框CTC09在受抑制的情况下,即可产生去甲金霉素[2]。去甲基金霉素作为四环类抗生素，其抗菌谱与金霉素及四环素相似，其作用比四环素、土霉素强，临床用于肺炎、尿路感染及小儿猩红热等，它可以作为医药原料，也可以作为合成米诺环素和替加环素的中间体。因此，在制药工业中，生产去甲金霉素具有良好的发展前途。

国内单纯对去甲基金霉素的研究并不多[3-4]；国外主要是关于四环类抗生素分子及代谢方面的研究[5-7]，去甲基金霉素的合成总共需要8个丙二酰CoA的参与，丙二酸在去甲基金霉素的生物合成中起着至关主要的作用[8]。根据文献[9]，丙二酰CoA的合成可由乙酰CoA通过羧化反应生成，随着乙酰CoA羧化酶活性降低，合成的丙二酰CoA也会降低。李友元[10]等报道某些金属离子可以不同程度的激活酰基辅酶。本实验就是通过摇瓶实验、小试试验、中试试验考察不同金属离子、不同添加浓度、不同添加时间对去甲金霉素发酵水平的影响，从而找到提高去甲金霉素发酵水平所需添加的金属离子。

1 仪器与材料

1.1 仪器

15升、50升、100升智能发酵罐、12m3发酵罐、超净工作台，恒温培养箱，摇床，显微镜，离心机，电子天平，1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)等。

1.2 菌种与培养基

菌种：金色链霉菌(Streptomyces aureus)为原始出发菌(天方药业有限公司提供)。 斜面培养基/g·L-1[8]：葡萄糖 10.0，牛肉膏 2.0，L- 门冬酰胺0.25，无水磷酸二氢钾 0.4，琼脂 20 ；pH值 6.8 ～ 7.0。

摇瓶种子培养基/g·L-1[8]：玉米淀粉 30，黄豆粉 30，蛋白胨 5，酵母粉 2，硫酸铵 2，碳酸钙 10，无水磷酸二氢钾 1.5，豆油 16 mL/L ；pH 自然。

摇瓶发酵培养基/g·L-1[8]：玉米淀粉 80，ɑ-淀粉酶 0.1%，黄豆粉 30，L- 赖氨酸盐 8，氯化钠 4，硫酸铵 3，碳酸钙 10，玉米浆 4，豆油 12 mL/L ；pH 自然。

稀料配方/g·L-1：玉米淀粉 100，ɑ-淀粉酶 0.1，L- 赖氨酸盐 7，豆油 30mL/L，碳酸钙 30；pH自然。

上述培养基均于121 ℃灭菌30 min。

2 方法与结果

2.1 培养方法

2.1.1 斜面培养

将菌种由沙土管接种到斜面培养基上,27±1℃培养14～16天,至斜面孢子变为白色,湿度控制在40%～50%。

2.1.2 摇瓶种子培养

在250mL摇瓶中加入30mL种子培养基,将培养基在121±1℃灭菌30min,然后将斜面孢子挑块至种子培养基中,27±1℃ , 210r/min摇床振荡培养46～48h,湿度控制在40%～50%。

2.1.3 摇瓶发酵培养

在250mL摇瓶中加入30mL发酵培养基,将培养基在121±1℃灭菌30min,然后按10%的接种量接种至发酵培养基中, 27±1℃,210r/min摇床振荡培养7d, 湿度控制在40%～50%。

2.1.4 种子培养

2.1.4.1 一级种子培养

将种子培养基在121±1℃灭菌30min,然后按0.02%的接种量接种至一级种子培养基中, 27±1℃,培养46～48h

2.1.4.2 二级种子培养

将种子培养基在121±1℃灭菌30min,然后按10%的接种量接种至二级种子培养基中, 27±1℃,培养27～30h

2.1.5 发酵培养

将发酵培养基在121±1℃灭菌30min,然后按5～10%的接种量接种至发酵培养基中, 27±1℃,培养9d。

2.2 HPLC测定去甲金霉素效价

色谱条件色谱柱C18 4.6×150mm 5μm粒径填料流速：1.0mL/min,检测波长：254nm,温度：30℃,流动相：V(乙腈)：V(1%磷酸液)=20：80,进样量：20μL。

2.3 实验结果

2.3.1 摇瓶实验：

2.3.1.1 在摇瓶发酵初期中分别加入Fe2+、Cu2+、Mg2+、Co2+等无机离子，每组结果为3只摇瓶的平均效价，得到的以对照为100.00的相对效价结果见表1：

表1

从以上结果可以看出添加Co2+及Fe2+可以提高去甲金霉素效价，其中添加0.02%的Co2+及添加0.015%的Fe2+提高较多，接着的摇瓶实验是对添加0.02%的Co2+及添加0.015%的Fe2+的添加时间进行优化。

2.3.1.2 在摇瓶发酵不同时期中分别加入0.015%Fe2+、0.02%Co2+无机离子，每组结果为3只摇瓶的平均效价，得到的以对照为100.00的相对效价结果见表2：

表2

从以上结果可以看出添加Co2+及Fe2+可以提高去甲金霉素效价，其中在摇瓶发酵48h添加最好，接着在100升智能发酵罐中对添加0.02%的Co2+及添加0.015%的Fe2+的添加时间进行优化。

2.3.2 小试

小试在100L智能发酵罐中进行，由于去甲金霉素发酵过程中溶解氧在16～30h处于低谷pH也较低，菌丝浓度偏低，菌种处于快速生长阶段，在36～54h溶解氧和pH已回升至正常水平，菌丝浓度达到相对较高浓度，菌体进入抗生素的合成期，所以选择实验分别在36h、42h、48h、54h添加0.015%Fe2+、0.02%Co2+，实验的培养基配方及工艺控制参数均按正常发酵工艺控制，实验结果见表3：

表3

从以上结果可以看出48h添加Co2+最好。去甲金霉素效价比对照提高19.48%，42h添加Fe2+也可以提高去甲金霉素的效价，比对照提高9.47%。接着在12m3发酵罐对Co2+进行中试验证

2.3.3 中试验证

在12m3发酵罐上连续进行5批进行批量验证，验证结果见表4：

表4

3 讨论

本研究通过摇瓶、小试、中试对多种金属离子进行筛选，通过对添加金属离子的浓度及添加时间的验证，选出了能提高去甲金霉素发酵效价的Co2+，通过添加Co2+可以使去甲金霉素发酵水平提高120.52%，发酵水平大幅提高，可以大幅降低生产成本，将产生巨大的经济效益及社会效益。

[1] 赵 谨,于淑秋,伍志春.中性磷类萃取去甲金霉素规律的研究.化工冶金[J],1992,13(2):145-150.

[2] 俞文和主编.新编抗生素工艺学.北京:中国建材工业出版社,1996年.

[3] 贺筱蓉;李永泉 原生质体诱变选育去甲基金霉素高产菌.杭州大学学报(自然科学版)[J].1997，24(2):170-177.

[4] 贺筱蓉;李永泉;李钧敏 去甲基金霉素发酵培养基优化研究，化学反应工程与工艺[J]. 1997，24(2)：170-177.

[5] Erban V，Novotná J，Běhal V，et al.Growth rate，sugar consumption，chlortetracycline production and anhydrotetracycline oxygenase activity in Streptomyces aureofaciens[J]. Folia Microbiological,1983,28(4):262-267.

[6] Vaněk Z,Cudlín J,Blumauerová M,et al.How many genes are required for the synthesis of chlortetracycline[J]. Folia Microbiological,1971,16(3):225-240.

[7] Li X M,Novomá J,Weiser J.Major proteins related to chlortetracycline biosynthesis in a Streptomyces aureofaciens production strain studied by quantitative proteomics[J]. Applied Microbiology,2002(5-6):717-724.

[8] 李士杭，叶蕊芳，吕和平,等.去甲基金霉素发酵培养基的优化及机制分析[J].中国医药工业杂志,2012, 43(11).896-901.

[9] 储 炬;李友荣，等.现代工业发酵调控学[M].北京：化学工业出版社，2002年.

[10] 李友元，陈长华，李永东等 酰基激酶和酰基CoA对螺旋霉素合成的影响[J].华东理工大学学报，2001,27(3)：251.

(本文文献格式：李翠平,李爱玲,王振坤.去甲金霉素添加金属离子工艺研究[J].山东化工，2016，45(12)：36-37,42.)

Technique Research of Metal Ions on Demethylchlortetracycline

Li Cuiping,Li Ailing,Wang Zhenkun

(Topfond Pharmaceutical Co., Ltd., Zhumadian 463000)

Demethylchlortetracycline was prepared from Streptomyces aureus. The metal ions was selected which could improve production level of Demethylchlortetracycline by adding different metal ions with different concentrations at different periods on flask-shaking and lab-scale fermentation tests. By five continuous tests in 12m3fermentation tank, proved that the production level of Demethylchlortetracycline could be improved to 120.52% by added 0.02% Co2+at 48h of the fermentation process.

demethylchlortetracycline; fermentation; metal ions

2016-04-19

李翠平(1969—)，女，河南息县人，工程师，主要从事生物化工研究。

TQ465

A

1008-021X(2016)12-0036-02