CD40基因多态性与原发免疫性血小板减少症的相关分析

魏　岩,何　娟,何　晖,屈慧丽,闫寒冰

(1.中国医科大学附属第一医院血液科,沈阳110001;2.本溪市中心医院科研实验室,辽宁本溪117000;3.本溪市中心医院血液科,辽宁本溪117000)

CD40基因多态性与原发免疫性血小板减少症的相关分析

魏岩1,何娟1,何晖2,屈慧丽3,闫寒冰3

(1.中国医科大学附属第一医院血液科,沈阳110001;2.本溪市中心医院科研实验室,辽宁本溪117000;3.本溪市中心医院血液科,辽宁本溪117000)

目的探讨CD40基因rs1883832和rs4810485位点的单核苷酸多态性(SNP)与中国辽宁地区汉族人群成人原发免疫性血小板减少症(ITP)易感相关性.方法采取病对照研究方法,选取160例成人初诊ITP住院患者(ITP组)和160例正常体检者(对照组)为研究对象.利用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)方法测定2个SNP位点多态性分布,计算2组的基因型频率和等位基因频率.结果rs1883832位点ITP组的CC基因型及C等位基因频率明显高于对照组(均P< 0.05),TT基因型及T等位基因频率低于对照组(均P<0.05).而rs4810485的基因型及等位基因频率2组分布差异无统计学意义(均P>0.05).结论CD40基因SNP位点rs1883832的C等位基因多态性可能与中国辽宁地区汉族ITP发病相关,而SNP位点rs4810485与ITP发病无相关性.

CD40基因;原发免疫性血小板减少症;单核苷酸多态性

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原发免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)属于自身免疫性疾病,又称特发性血小板减少性紫癜,是临床最常见的出血性疾病,约占出血性疾病的30%.研究[1]发现除体液免疫外,细胞免疫在ITP发病机制中的作用不容忽视,其中自身反应性T细胞的异常活化起着关键性作用,一旦自身免疫耐受机制被打破,它可辅助相同自身抗原特异性B细胞产生自身抗体导致自身免疫病ITP的发生.

CD40(Bp50)是与T细胞和B细胞功能有关的一种表面抗原,是分子质量为(45～50)X103的Ⅰ型跨膜糖蛋白,由277个氨基酸组成,包括细胞外区、跨膜区和细胞内区,它属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)受体家族细胞因子.CD40基因定位于20q11,属于神经生长因子受体/TNF受体超家族成员,主要表达于B细胞发育和分化的各个阶段,单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、树突状细胞和上皮细胞亦能表达CD40.有研究[2]显示B细胞水平在ITP患者体内显著高于正常组,B细胞表面CD40表达水平也显著高于正常组.已证实[3～5]CD40基因多态性在系统性红斑狼疮,免疫性甲状腺性疾病[6,7]、类风湿性关节炎[8]、川崎病[9,10]等免疫性疾病异常表达,本研究应用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(po1ymerase chain reaction-restriction fragment 1ength po1ymor phism,PCR-RFLP)方法进行研究,旨在探讨CD40基因多态性与中国辽宁地区汉族人群ITP之间的关系,为ITP的预防提供分子流行病学实验依据.

1　材料与方法

1.1研究对象

经患者知情同意,本研究征集了中国医科大学本溪中心医院2008年11月至2014年7月住院确诊为ITP初诊成人患者160例(病例组).男53例,女107例,平均年龄50岁.入选标准参照文献[11]确定.选择160例健康成年体检者为对照组,男78例,女82例,平均年龄56岁.病例组与对照组均为辽宁汉族人群.

1.2研究方法

1.2.1外周血基因组DNA提取:在签署知情同意书之后,抽取患者外周血3 mL,枸橼酸钠抗凝,在-20～-80℃的冰箱中冻存.应用血液基因组天根DNA提取试剂盒离心柱型提取基因组DNA.

1.2.2CD40基因rs1883832位点PCR扩增及基因型分析:引物由生工生物工程上海股份有限公司设计合成.上游引物序列,5′-CCCATGGGCACAGCAAG ATGCGTCCC-3′,下游引物序列,5′-CCCATGGGCC TTCTCATTCCCCACTC-3′.应用美国Gene Amp 9700PCR仪扩增目的片段,扩增条件为:95℃预变性10 min;94℃变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s共40个循环;末次循环后72℃延伸7 min结束反应.用限制性内切酶NcoⅠ在37℃水浴16 h酶切PCR产物,2%琼脂糖凝胶电泳确定基因型.

1.2.3CD40基因rs4810485位点PCR扩增及基因型分析:引物由生工生物工程上海股份有限公司设计合成.上游引物序列,5′-ACCGTATCTTGGGTGTT CCA-3′,下游引物序列,5′-CTGCTTCCCTTGCTTT CCTT-3′.应用美国Gene Amp 9700PCR仪扩增目的片段,扩增条件为:95℃预变性10 min;94℃变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s共40个循环;末次循环后72℃延伸7 min结束反应.用限制性内切酶Msp1在37℃水浴16 h酶切PCR产物,2%琼脂糖凝胶电泳确定基因型.

1.3统计学分析

所有结果应用SPSS 17.0软件进行统计分析.以Hardy-Weinberg平衡检验分析研究样本的群体代表性,计算每组的基因型频率和等位基因频率.计数资料采用χ2检验,以OR值及95%可信区间(95% CI)估计相对危险度.检验水准α=0.05.

2　结果

2.1两位点的酶切结果

2.1.1rs1883832位点的酶切结果:CD40基因rs1883832位点上有C或T碱基的变化,根据限制性内切酶NcoⅠ酶切片段的情况基因型有3种:CC基因型(227 bp、105 bp 2条带)、TT基因型(332 bp 1条带)、CT基因型(332 bp、227 bp、105 bp 3条带).见图1.

图1　NcoⅠ酶切rs1883832位点PCR扩增产物Fig.1 Identification of rs1883832 PCR p roducts by NcoⅠrestriction assay

2.1.2rs4810485位点的酶切结果:CD40基因rs4810485位点上有C或G碱基的变化,根据限制性内切酶Msp1酶切片段的情况基因型有3种:GG基因型(272 bp、163 bp 2条带)、CC基因型(435 bp 1条带)、CG基因型(435 bp、272 bp、163 bp 3条带),见图2.

图2　Msp l酶切rs4810485位点PCR扩增产物Fig.2 Identification o f rs4810485 PCR products by Mspl restriction assay

2.2两位点的多态性分析

2.2.1rs1883832位点的多态性分析:ITP组的CC基因型及等位基因频率明显高于对照组(P均<0.05; ITP组的TT基因型及T等位基因频率低于对照组(均P<0.05,表1).

2.2.2rs4810485位点的多态性分析:ITP组与对照组之间分布差异无统计学意义,等位基因频率在2组间差异也无统计学意义(均P>0.05,表2).

表2　ITP组与对照组rs4810485位点基因型及等位基因频率的比较Tab.2Genotype distribution and allele frequency of the rs4810485 polymorphism in ITP and controls

3　讨论

CD40基因rs1883832位点位于5′非翻译区、mRNA翻译起始密码子ATG上游-1碱基处,CD40基因分布在质膜,参与免疫应答信号转导过程.其配体CD40L,又名TRAP(TNF-re1ated activation ptotein),是肿瘤坏死因子家族成员之一.它们之间的相互作用不仅在体液免疫中扮演重要角色,而且在调节细胞介导的免疫应答中也发挥着重要的作用.CD40-CD40L交联对B细胞的活化、增殖、抗体的产生以及Ig类别转换都起了非常重要的作用.一方面,不仅CD40-CD40L交联可以增加B细胞DNA的合成,引起静止B细胞的复制,而且CD40单克隆抗体单独也可以促使B细胞增殖,使B细胞表面多种黏附分子呈现高亲和状态,从而导致细胞聚集,有助于T、B细胞的相互作用.通常血小板内和膜表面低表达CD154(CD40L),当血小板活化后其表达增加,这对于ITP的发病有重要意义:血小板表面的CD154与血小板上抗原(GPⅡb/Ⅲa等)一起为B细胞活化提供共刺激信号,且血小板源CD154能促进DC向成熟分化,上调DC共刺激分子的表达.在ITP患者体内血小板相关性CD154表达升高,且导致患者自身反应性B淋巴细胞异常活化.ITP患者外周血CD40及CD154表达升高,推测血小板相关的CD154表达升高可以诱导患者CD40依赖的自身反应性B淋巴细胞活化,在ITP发病中起重要作用.

Liu等[12]研究了CD40基因多态性在中国类风湿性关节炎患者中的易感性,表明CD40rs1883832可能与类风湿性关节炎相关.Prasad等[13]全基因组关联研究和荟萃分析表明:在欧洲和亚洲的人口中, CD40基因与类风湿性关节炎具有相关易感性.在希腊和土耳其系统性红斑狼疮研究中,CD40已经被确定为一个新的易感性位点,潜在影响调节异常的免疫反应疾病.调查表明CD40基因rs4810485多态性与系统性红斑狼疮的风险性增加有关.本文研究了辽宁汉族人群中ITP患者CD40基因rs1883832和rs4810485位点的多态性,结果表明SNP位点rs1883832与ITP易感性相关,推测可能的原因是影响CD40的表达量,进而影响CD40-CD40L等炎性信号反应通路,这一推测需要进一步的实验证明.ITP患者CD40基因rs1883832位点的T碱基向C碱基的突变导致个体ITP易感倾向不同.目前认为,C等位基因能上调CD40在B淋巴细胞表达而T等位基因则相反,C等位基因可能是通过增加CD40的翻译效率而导致对疾病的易感性.而SNP位点rs4810485位于CD40基因内含子上面,与ITP的易感不相关,可能原因是SNP不影响蛋白的功能和表达量.

鉴于本组研究涉及例数有限,研究中观察到的结果有待扩大样本进一步证实.我们尚需要加大样本,从家系的角度不同地域、不同人种分析研究CD40基因多态性,同时联合检测相关基因多态性,分析相关基因联合对ITP病的影响,以便提高个体ITP病易感性的预测水平,筛查高危人群,从而加强ITP的早期预防、诊断及判断预后.

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(编辑武玉欣)

Correlation between CD40GenePolymorphism and Immune Thrombocytopenia

WEIYan1,HEJuan1,HEHui2,QUHui-1i3,YANHan-bing3
(1.Depatment of Hemato1ogy,The First Hospita1,China Medica1 University,Shenyang 110001,China;2.Scientific Research Laboratory,Benxi Centra1 Hospita1, Benxi117000,China;3.DepatmentofHemato1ogy,BenxiCentra1Hospita1,Benxi117000,China)

Objective To study the corre1ation between two sing1e nuc1eotide po1ymorphism(rs1883832 and rs4810485 in CD40 gene)and immune thrombocytopenia(ITP)in the Liaoning region of the Han Chinese adu1t.Methods A case-contro1 study was performed on 160 new1y diagnosed adu1t ITPpatientsand160norma1contro1s.Thepo1ymorphism oftwoSNPsin CD40 geneweredetected usingPCR-RFLP,eachgenotype frequency and a11e1e frequency was ca1cu1ated.Results The CC genotype and Ca11e1e in ITP group was higher than that in contro1(P<0.05).The TT genotype and T a11e1e in ITP group was significant1y 1ower than that in contro1(P<0.05).There was no significant difference in the genotype distribution ora11e1e frequencyofSNP rs4810485 in CD40 genebetween the ITPand norma1groups(P>0.05).Conclusion Thepo1ymorphism ofCa1-1e1e CD40 gene rs1883832maybe associatedwith ITPin LiaoningHan Chinese,whi1eSNPrs4810485maynot.

CD40 gene;immune thrombocytopenia;sing1e nuc1eotide po1ymorphism

R558.2

A

0258-4646(2016)03-0237-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.03.012

魏岩(1980-),女,主治医师,本科.

何娟,E-mai1:hejuan-2006@126.com

2015-05-16

网络出版时间: