黄连解毒汤等对乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤酸性微环境p H值的影响*

张翔云 周华妙郭 勇

（浙江中医药大学第一临床医学院·杭州 310053）

黄连解毒汤等对乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤酸性微环境p H值的影响*

张翔云 周华妙⋆⋆郭 勇

（浙江中医药大学第一临床医学院·杭州 310053）

目的：研究中医药对乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤微环境pH值的影响。方法：测量并比较乳腺癌荷瘤小鼠单纯荷瘤组与中药干预组的肿瘤上清液pH值，分析结果并探讨中医药对于乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤酸性微环境pH值的影响。结果：黄连解毒汤组乳腺癌肿瘤组织pH值（7.0400±0.8732）与单纯荷瘤组乳腺癌肿瘤组织pH值（6.8625±0.5620）相比上升，统计学差异显著（p＜0.05）；四君子汤组乳腺癌肿瘤组织pH值（6.9525±0.2217）与单纯荷瘤组乳腺癌肿瘤组织pH值（6.8625±0.5620）相比上升，统计学差异显著（p＜0.05）；其中黄连解毒汤组与单纯荷瘤组之间统计学差异非常显著（p＜0.01）。结论：黄连解毒汤、四君子汤加减可以明显增高乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤组织的pH值，而这种调节作用的产生机制及对于肿瘤侵袭转移能力的具体影响仍需要对后续试验结果进行分析以补充。

乳腺癌 中医药 小鼠 肿瘤酸性微环境 pH值

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率呈现上升趋势，已成为女性恶性肿瘤发病率之首，究其最常见的死亡原因，并非原发肿瘤，而是转移性疾病。已有大量研究发现，乳腺癌肿瘤微环境和肿瘤血管生成与乳腺癌的侵袭和转移关系密切。

转移被认为是肿瘤与细胞基质相互作用的多阶段过程，这些过程使得肿瘤具有新生血管的能力，使肿瘤细胞更容易迁移和侵袭到转移部位。一旦肿瘤新生物表现出侵袭性，就能够通过淋巴管和(或)血管播散，包括借助于肿瘤刺激淋巴管生成和血管生产，或者改变局部的微环境而播散[1]。

肿瘤微环境(tumor microenvironment)的思想最早可见于100多年前Paget提出的“种子-土壤”学说。狭义的肿瘤微环境的定义是肿瘤组织中的各种细胞和结构构成肿瘤微环境。但广义来说，肿瘤细胞所处的外部环境，或肿瘤组织所处的外部环境也可理解为肿瘤微环境[2]。具体是指肿瘤在生长过程中，与肿瘤的发生、发展和转移密不可分的局部稳态环境[3]。

研究证实，恶性肿瘤组织周围的pH值在6.8～6.0之间，更有低至5.8。而正常组织周围的pH值一般保持在7.35～7.45之间［4-6］。肿瘤微环境酸性的形成，一方面是由于其高效率的糖酵解生成的乳酸所致[7-12]，即主要是无氧代谢决定了肿瘤的酸度。另一方面，胞内产生的CO2通过弥散作用排到胞外，由于肿瘤组织细胞缺氧，激活缺氧诱导因子1(hypoxiainducible factor1，HIF-1)诱导肿瘤细胞高表达CA-Ⅸ，催化CO2和H2O反应生成碳酸[13]。这就提示，乳酸和碳酸是肿瘤细胞外酸性微环境的主要来源，以及肿瘤酸性微环境的形成原因主要与肿瘤细胞的糖酵解代谢和缺氧有关[14]。肿瘤酸性微环境对肿瘤细胞生长转移的影响主要是：①改变肿瘤细胞的生物学活性[15]，从肿瘤发病机制到治疗各个环节的研究领域都与肿瘤酸性微环境有关；②通过上调VEGF等基因表达，促进肿瘤新生血管生成[16]。可见，肿瘤细胞的生长转移与肿瘤酸性微环境密切相关。

已有许多实验证明酸性微环境对肿瘤的生长和转移有很大影响[17-20]，本次研究意在从中医药调整乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤微环境pH值的角度出发，观察黄连解毒汤、四君子汤加减等中医方药对乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤微环境pH值的调整作用，进而为中医药对肿瘤转移侵袭能力等影响做好研究准备。

1 材料与方法

1.1 材料

Hanks缓冲液（吉诺），精细眼科剪、精细组织镊（美国瑞德）、delta320ph计（梅特勒-托利多仪器有限公司）等。

1.2 活体肿瘤制备肿瘤上清液

6～8周龄Balb/c小鼠按区组随机分为空白对照组、单纯荷瘤组、黄连解毒汤组、四君子汤组四组，并于单纯荷瘤组、黄连解毒汤组、四君子汤组小鼠乳腺脂肪垫接种乳腺癌4T1高转移细胞，接种后24h给药：单纯荷瘤组：以饮用水灌胃，每日0.4ml/只；黄连解毒汤组：以黄连解毒汤灌胃，每日0.4ml/只；四君子汤组：以四君子汤加味灌胃，每组0.4ml/只。35天后处死取出瘤体。

每组处死4只小鼠，空白对照组取乳腺脂肪垫组织，单纯荷瘤组、黄连解毒汤组、四君子汤组取出瘤体，以眼科剪充分剪碎，分别放入Hanks缓冲液中（300mg/ml）,混匀后以300G室温离心10min。吸取上清液，过滤后得到肿瘤组织上清。

1.3 检测肿瘤组织上清pH值

检测方法：

以旋转的方式把PH电极从保存液中拔出，使用蒸馏水清洗并拭干-校正-清洗并拭干，后分别浸入空白对照组、单纯荷瘤组、黄连解毒汤组、四君子汤组四组样本中进行测量、读数（每次测量后需重新校正清洗）。

每支样本重复测量三次，取三次结果的平均值。

1.4 统计方法

结果采用SPSS17.0软件包统计。计量资料数据用均数±标准差（）表示。采用方差分析，以P＜0.05为差异显著、P＜0.01为差异非常显著的检验标准。

2 结果

pH值 均值标准差1#2#3#4#空白对照组7.347.377.367.417.37000.2944单纯荷瘤组6.916.916.806.836.86250.5620黄连解毒汤组6.987.106.927.097.04000.8732四君子汤组6.966.966.976.926.95250.2217

各组间组织pH值比较结果如下：（Hanks缓冲液pH值测出为7.246）

如图，空白对照组乳腺脂肪垫组织pH值为7.3700±0.2944，与相关文献所载正常组织周围pH值（7.35～7.45）基本相符。黄连解毒汤组乳腺癌肿瘤组织pH值（7.0400±0.8732）与单纯荷瘤组乳腺癌肿瘤组织pH值（6.8625±0.5620）相比上升，统计学差异显著（p＜0.05）；四君子汤组乳腺癌肿瘤组织pH值（6.9525±0.2217）与单纯荷瘤组乳腺癌肿瘤组织pH值（6.8625±0.5620）相比上升，统计学差异显著（p＜0.05）；其中黄连解毒汤组与单纯荷瘤组之间统计学差异非常显著（p＜0.01）。

3 小结

肿瘤酸性微环境是肿瘤细胞进行缺氧和有氧糖酵解代谢产生的乳酸和缺氧所致的HIF-1激活相关酶催化CO2变成碳酸在胞内聚集，迫使肿瘤细胞上调膜离子交换体以调节形成适应肿瘤生长转移的胞内呈碱性和胞外呈酸性的微环境,抗肿瘤细胞生长转移的关键则在于调节膜离子交换体、调整酸性微环境和调控营养物质[21]。通过分析本次研究结果，我们发现黄连解毒汤、四君子汤可以明显升高乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤组织的pH值，而这种调节作用的发生机制及对于肿瘤侵袭转移能力的具体影响仍需要对后续试验结果进行分析以补充。

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（2016-08-10 收稿）

* 课题：基于TAMS与酸性微环境观察梳肝健脾法治疗小鼠乳腺癌肿瘤转移的实验研究

** 通讯作者