PirAB毒力正在向亲缘关系较远的非副溶血弧菌中转移

■ 陈营李云冰张文文谭鲜英（ 广州利洋水产科技股份有限公司 烟台大学）

PirAB毒力正在向亲缘关系较远的非副溶血弧菌中转移

■ 陈营12李云冰1张文文1谭鲜英1（1 广州利洋水产科技股份有限公司 2 烟台大学）

副溶血弧菌是一种嗜盐性海洋细菌，广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼、虾、贝类动物中。在夏秋季，副溶血弧菌是全球沿海地区致人腹泻的主要病原菌，在我国此菌也长期居于食物中毒已检出致病菌的前列。近些年，在对虾养殖中出现了一株特殊的副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus,Vp），由于携带1个约69kb的大质粒，使其完全不同于从临床上和环境中分离的菌株。该菌株在质粒上有两个与昆虫致病相关的毒素基因pirA和pirB，它们分别表达1个13 kDa和50kDa的外毒素蛋白PirA和PirB，我们称这个菌株为PirAB型副溶血弧菌（PirAB-Vp）。由于pirAB毒素基因在质粒上，通过质粒在细菌种内和种间的转移，细菌可以获得相应的毒力。Kondo等首次报道了PirAB毒力通过质粒向非副溶血弧菌中转移的现象。他们在越南北部地区的病虾中分离出1株弧菌KC13.17.5，通过对此菌株的基因组测序，发现它属于哈维氏弧菌（V.harveyi）。随后，Liu等在V.owensii中也检测出pirAB毒素基因，这是1个与哈维氏弧菌亲缘关系很近的1个弧菌新种。在此之后，我们也检测出携带pirAB毒素基因的哈维氏弧菌，并在今年的检测中发现了更多该毒力基因向其它弧菌、甚至肠道细菌转移的现象。

本文分析了PirAB毒力向非副溶血弧菌转移的现象以及PirAB非副溶血弧菌之间的亲缘关系，希望为对虾疾病的防控提供一定的理论指导。

表1 基于16S rDNA的PirAB非副溶血弧菌的亲缘关系分析

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病虾和水样的采集

在养殖南美白对虾发病时，采集病虾的肝胰腺和水样，接种TCBS平板。然后，送利洋公司研究所进行PirAB-Vp检测。

1.1.2 病虾和水体PirAB-Vp检测

挑取TCBS平板上的单菌落或转接的过夜培养物，煮沸法制备细菌基因组模板，采用PCR方法进行副溶血弧菌和pirA毒素基因的检测，选取部分携带pirA毒素基因的非副溶血弧菌进行16S rDNA测序。

1.1.3 PirAB非副溶血弧菌的16S rDNA鉴定

采用细菌16S rDNA通用引物27F和1492R，进行PirAB非副溶血弧菌16SrDNA序列的PCR扩增。经上海美吉生物医药科技有限公司对16S rDNA序列进行部分测序后，在美国国家生物工程信息中心（NCBI）网站上进行Blast比对分析，确定分离菌株的最可能种属。

1.1.4 分离菌株的亲缘关系分析

采用欧洲生物信息学网站（EMBL）上的Clustal Omega软件，以网上已知的哈维氏弧菌的16S rDNA序列（基因库编号：NR_102976）为参照标准， 逐一对测定的16S rDNA部分序列与之进行比对分析，确定两者之间的亲缘关系大小。

2 结果

2.1 非副溶血弧菌pirA毒素基因的检测及菌株的亲缘关系分析

2015年10～11月共检测出22株PirAB非副溶血弧菌；2016年4月检测出23株，5月检测出21株。对部分菌株进行了16S rDNA测序鉴定并进行亲缘关系分析，见表1。

表2 部分PirAB非副溶血弧菌的来源与亲缘关系分析

在鉴定的菌株中，主要为哈维氏弧菌及与其亲缘关系较近的弧菌，如V.owensii、创伤弧菌（V.vulnificus）、V.shilonii，相似率由100%降至86.89%。也有亲缘关系较远的霍乱弧菌（V.cholerae）、肠杆菌（Enterobacter）、克雷伯氏菌（Klebsiella），相似率为92.32%～94.78%，。

2.2 PirAB毒力已经向亲缘关系较远的非副溶血弧菌中转移

2015年10～11月鉴定的PirAB非副溶血弧菌均为哈维氏弧菌。而在今年4月开始出现V.owensii和创伤弧菌。到5月时，检测出的PirAB非副溶血弧菌种类更多，亲缘关系也更远，相似率最低至92.32%。更重要的是，从检测的样本看，从肝胰腺检测的菌株亲缘关系相对较近，亲缘关系较远的菌株均是在水中检出的。而且，除了1株克雷伯氏菌外，其余均来自广西钦州地区的养殖水样，详见表2。

2.3 各地区PirAB非副溶血弧菌的检出情况

2016年4～5月是PirAB-Vp检出的高发期，pirA阳性菌株检出率平均高达43.4%。其中，PirAB非副溶血弧菌为7.5%（另文发表）。在送检的广东、广西、福建、海南、江苏地区样本中，均检出PirAB非副溶血弧菌。其中，以福建、广西、广东、海南地区检测率较高，江苏的检出率最低。广西只在水中检出，为最高值25%；福建只在肝胰腺检出，为最高值26.9%。结果见图1。

图1 4月和5月各地区PirAB非副溶血弧菌的检出情况

3 讨论

迄今为止，在国内外仅见两例关于PirAB毒力通过质粒向非副溶血弧菌中转移的报道，所转移的非副溶血弧菌为哈维氏弧菌和V.owensii，并无向其它更多弧菌转移的报道。我们在2015年10～11月和2016年4～5月共检测出66株PirAB非副溶血弧菌，获得了很多关于PirAB毒力转移的资料。

2016年4～5月是pirA阳性菌株检出的高峰期，造成了携带pirAB毒素基因的质粒向副溶血弧菌和其他弧菌的广泛转移，使得PirAB非副溶血弧菌的检出率高达7.5%。去年的检测发现，PirAB毒力转移仅局限于哈维氏弧菌。而到今年的4、5月份，PirAB毒力转移的菌种更多、亲缘关系更远、危害更严重。

PirAB非副溶血弧菌在福建、广西、广东、海南地区检测率较高，局地有高于25%的检出率，表明毒素基因传播较活跃。只在广西地区的水样和福建地区的虾样中检出PirAB非副溶血弧菌，可能与这两个地区分别采取的弧菌防控措施有关。江苏地区的PirAB非副溶血弧菌检出率很低，说明毒素基因传播的环境相对比较局限或者养殖水体交换少。

从PirAB非副溶血弧菌的亲缘关系上看，所有亲缘关系较远的菌株均来自养殖水体，说明毒素质粒在水中传播的更广泛、更频繁。在一个地域内，水源可能是毒素质粒传播和扩散的主要途径。由于外界不利环境的胁迫，会加速毒素质粒在细菌群体间的转移。霍乱弧菌、肠杆菌、克雷伯氏菌是常见的、人的肠道致病菌，这些潜在致病菌在水中出现，说明水体受污染的可能性很大，而这种污染加剧了毒素质粒的传播。因此，搞清毒力基因的流行与传播规律，控制质粒转移，是防止PirAB毒力在弧菌中广泛流行与传播的关键。