活血解毒方对干燥综合征小鼠干扰素-γ、B细胞活化因子及其受体的干预作用研究

史云晖　柳　洋　韦　尼　刘小平　朱跃兰

活血解毒方对干燥综合征小鼠干扰素-γ、B细胞活化因子及其受体的干预作用研究

史云晖柳洋韦尼刘小平朱跃兰

目的 探索活血解毒方对干燥综合征小鼠干扰素(interferon,IFN)-γ、B细胞活化因子(B cell activating factor belonging to the TNF family,BAFF)及其受体BAFF-R的影响及其机制.方法以C57BL/6j小鼠及NOD/Ltj小鼠为实验动物,分别以蒸馏水、白芍总苷混悬液、活血解毒方汤剂灌胃干预,干预过程中观察小鼠一般状态,于干预60天后测量小鼠唾液流率,并取小鼠颌下腺及血清,测量颌下腺指数及血清中BAFF、BAFF-R、IFN-γ及颌下腺BAFF、BAFF-R水平.结果 正常组唾液流率均较其他各组高(P<0.05),实验第40天开始,对照组及治疗组的唾液流率开始较模型组升高(P<0.05),而对照组与治疗组之间差异不明显(P>0.05);第60天对照组与治疗组之间差异明显(P<0.05).颌下腺指数,正常组较模型组、对照组、治疗组高(P<0.05).模型组较对照组、治疗组低(P<0.05),对照组与治疗组之间差异不明显(P>0.05).血清BAFF、BAFF-R、IFN-γ及颌下腺BAFF、BAFF-R水平,正常组均较模型组、对照组、治疗组低(P<0.05),模型组较对照组、治疗组高(P<0.05),其中对照组水平高于治疗组(P<0.05),各组之间比较,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 活血解毒方可减轻NOD小鼠颌下腺炎症,增加唾液分泌量,降低血清中BAFF、BAFF-R、IFN-γ及颌下腺BAFF、BAFF-R的水平,从而达到治疗干燥综合征的作用.

干燥综合征; B细胞活化因子; 干扰素; 中医; 活血解毒

干燥综合征是一种以侵犯泪腺、唾液腺等外分泌腺体为主,以口腔或眼干燥为主要表现的慢性自身免疫性疾病.其主要病理表现是外分泌腺体的灶性淋巴浸润.各种细胞因子和炎症递质造成组织损伤,其中在T辅助细胞的作用下,B淋巴细胞功能异常,产生多种自身抗体、多克隆免疫球蛋白以及免疫复合物,致使唾液腺和泪腺等组织发生炎症和破坏性病变.近年来应用利妥昔单抗进行B细胞损耗治疗取得良好疗效[1-2].这使得B细胞在干燥综合征发病中的重要地位越来越受到关注.研究发现干燥综合征患者的血清及靶器官中的B细胞活化因子(B cell activating factor belonging to the TNF family,BAFF)水平升高[3-4].BAFF/BAFF-R在干燥综合征发病中有着关键的作用.BAFF的表达受到干扰素(interferon,IFN)-γ、白细胞介素(interleukin,IL)-10、IL-4等细胞因子的调控,有研究表明IFN-γ处理单核细胞可增加BAFF表达.同时,IFN-γ又受到Toll样受体等调节.

干燥综合征的中医病机离不开瘀毒,临床应用活血解毒方治疗干燥综合征疗效确切[5],但其作用机制尚不明确,目前相关基础研究较少.本课题组前期发现,活血解毒方对NOD小鼠的血清及颌下腺的Toll样受体有一定的干预作用[6].本研究拟用活血解毒方干预干燥综合征模型小鼠,测量其唾液流率、颌下腺指数,测定其血清及颌下腺BAFF/BAFF-R水平、血清IFN-γ水平,从IFN-γ/BAFF/BAFF-R信号通路的角度分析干燥综合征的作用机理及活血解毒方的作用途径,为干燥综合征的中医药治疗提供基础研究依据.

1　材料与方法

1.1实验动物

C57BL/6j小鼠10只,雌性,体质量16～18 g; NOD/Ltj小鼠30只,雌性,体质量16～18 g.均由北京华阜康生物科技股份有限公司提供,许可证号:SCSY(京)2014-004.饲养于中国中医科学院中药研究所的屏障环境中,恒温恒湿,水瓶给水,自由进食.

1.2材料及仪器

帕夫林胶囊(主要成分为白芍总甙,300 mg/粒,由宁波立华制药有限公司生产,生产批号:121204 EXP2014-11);活血解毒方(丹参30 g、连翘15 g、川芎15 g、鸡血藤20 g、玄参20 g、甘草10 g、生地黄30 g、麦门冬20 g、石斛20 g、南沙参15 g、北沙参15 g、炒白芍30 g,由北京中医药大学东方医院中药房提供)制成200 mL水煎剂.小鼠BAFF试剂盒(购自普博欣生物有限公司);小鼠BAFF-R试剂盒(购自普博欣生物有限公司);小鼠IFN-γ试剂盒(购自普博欣生物有限公司);酶标仪(Thermo公司生产,型号MK3).

表1　各组小鼠唾液流量比较(±s,mg/min)

表1　各组小鼠唾液流量比较(±s,mg/min)

注:与正常组相比,aP<0.05;与模型组相比,bP<0.05;与对照组相比,cP<0.05.

组别n第0天第20天第40天第60天正常组915.53±1.3716.07±1.2216.62±1.3417.17±1.56模型组84.25±0.28a4.56±0.43a4.70±0.32a4.86±0.28a对照组84.56±0.35ab4.90±0.20ab6.07±0.25ab7.56±0.47ab治疗组84.53±0.31ab4.78±0.24ab6.60±0.38ab8.37±0.29abc

1.3实验动物分组及给药

C57BL/6j小鼠10只,作为正常组,NOD小鼠30只,随机分为模型组、对照组、治疗组,每组各10只.正常组及模型组小鼠给予蒸馏水灌胃10 mL/kg;对照组小鼠给予帕夫林胶囊制成的混悬液灌胃,根据小鼠与人的体表面积比值换算,予234 mg/kg;中药组与活血解毒方中药煎剂灌胃,根据小鼠与人的体表面积比值换算将中药煎剂进行相应比例的浓缩,予31.2 g/kg.每天给药1次,连续60天.

1.4一般状态观察

观察小鼠精神状态、活动、饮水、摄食、睡眠状态.

1.5唾液流量及颌下腺指数测定

唾液分泌量:于给药后动态测定小鼠唾液分泌量.测量前做好棉球称干重(5.5±1.0)mg.测唾液分泌时将干棉球放入实验用动物口颊内,3分钟后取出称湿重.唾液分泌量(mg)=湿重(mg)-干重(mg).

颌下腺指数:将小鼠摘眼球放血处死,取一侧颌下腺称重.颌下腺指数=颌下腺重量(mg)/小鼠体质量(g).

1.6BAFF、BAFF-R及IFN-γ水平测定

血清BAFF及BAFF-R水平测定:眼眶取血,静置1小时后,以3000 rpm转速离心10分钟,分离血清,用酶联免疫吸附法测定BAFF、BAFF-R、IFN-γ水平;取小鼠一侧颌下腺,匀浆后用酶联免疫吸附法测定BAFF及BAFF-R水平;按试剂盒提供的操作流程进行.

1.7统计学处理

使用统计软件SPSS 12.0进行统计分析,所得数据以均数±标准差表示.经检验数据符合正态分布,方差齐.组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两两比较采用LSD法,以P<0.05为差异有统计学意义.

2　结果

2.1唾液流量

各时间点正常组与模型组、对照组、治疗组相比均有明显差异(P<0.05);实验开始时及第20天时,模型组、对照组、治疗组之间无明显差异(P>0.05);第40天模型组开始与对照组、治疗组出现明显差异(P<0.05),而对照组与治疗组之间差异不明显(P>0.05);第60天对照组与治疗组之间差异明显(P<0.05).具体数值见表1.

2.2颌下腺指数

正常组与模型组、对照组、治疗组相比,差异显著(P<0.05).模型组与对照组、治疗组相比,差异显著(P<0.05).但对照组与治疗组之间差异不明显(P>0.05).具体数值见表2.

表2　各组小鼠颌下腺指数比较(±s,mg/g)

表2　各组小鼠颌下腺指数比较(±s,mg/g)

注:与正常组相比,aP<0.05;与模型组相比,bP<0.05.

颌下腺指数正常组组别n 5.53±0.74模型组84.06±0.53a对照组84.81±0.25ab治疗组84.89±0.66 9 a b

2.3血清BAFF及BAFF-R水平

正常组血清BAFF及BAFF-R含量较低,模型组血清BAFF及BAFF-R含量较高,对照组与治疗组血清BAFF及BAFF-R含量均低于模型组,其中治疗组的血清BAFF及BAFF-R含量又较对照组低,各组之间比较,差异具有统计学意义(P<0.05).具体数值见表3.

表3　各组小鼠血清BAFF及BAFF-R水平测定(±s,ng/L)

表3　各组小鼠血清BAFF及BAFF-R水平测定(±s,ng/L)

注:与正常组相比,aP<0.05;与模型组相比,bP<0.05;与对照组相比,cP<0.05.

水平正常组组别n血清BAFF水平血清BAFF-R 91515.35±50.13350.74±15.91模型组82474.32±98.77a611.02±26.69a对照组82184.11±31.12ab545.08±18.70ab治疗组81905.25±46.09abc434.96±36.70abc

2.4颌下腺BAFF及BAFF-R水平

正常组颌下腺BAFF及BAFF-R含量较低,模型组颌下腺BAFF及BAFF-R含量较高,对照组与治疗组颌下腺BAFF及BAFF-R含量均低于模型组,其中治疗组的颌下腺BAFF及BAFF-R含量又较对照组低,各组之间比较,差异具有统计学意义(P<0.05).具体数值见表4.

表4　各组小鼠颌下腺BAFF及BAFF-R水平测定(±s,ng/mL)

表4　各组小鼠颌下腺BAFF及BAFF-R水平测定(±s,ng/mL)

注:与正常组相比,aP<0.05;与模型组相比,bP<0.05;与对照组相比,cP<0.05.

组别nBAFF水平BAFF-R 水平正常组932.03±8.2070.99±10.15模型组873.16±9.71a112.40±10.89a对照组863.84±9.38ab92.98±12.24ab治疗组847.53±8.16abc81.87±9.97abc

2.5血清IFN-γ水平

正常组血清IFN-γ含量较低,模型组血清IFN-γ含量较高,对照组与治疗组血清IFN-γ含量均低于模型组,其中治疗组的血清IFN-γ含量又较对照组低,各组之间比较,差异具有统计学意义(P<0.05).见表5.

表5　各组小鼠血清IFN-γ水平测定(±s,ng/L)

表5　各组小鼠血清IFN-γ水平测定(±s,ng/L)

注:与正常组相比,aP<0.05;与模型组相比,bP<0.05;与对照组相比,cP<0.05.

组别nIFN-γ正常组33.56±11.11模型组893.22±14.01a对照组862.85±14.53ab治疗组850.23±13.94 9 a bc

3　讨论

BAFF又叫B淋巴细胞激活因子(B-lymphacyte stimulator,BLyS),主要由单核细胞、树突状细胞、T细胞、B细胞和唾液腺上皮细胞分泌产生[7-8],是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)家族中的一员,它能与B淋巴细胞特异性结合并诱导期增值、分化并分泌免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)G、IgA和IgM等,在体液免疫中发挥着重要的作用.包括干燥综合征在内的许多自身免疫性疾病患者体内都有BAFF过表达的现象[4-5].BAFF有很强的B细胞趋向性,BAFF可促进B细胞的增殖和分化,如果BAFF缺失,B细胞将停留在T1阶段.BAFF还能抑制B细胞的凋亡.如果不考虑受体的表达水平,BAFF是B细胞T2阶段凋亡的主要阻力因素. BAFF转基因小鼠的外分泌腺可以表达T2细胞,这同干燥综合征患者唾液腺中B细胞聚集相同[9].由于新形成的B细胞依赖于BAFF,研究人员推测,在细胞聚集区及其周围细胞可产生大量的BAFF.有研究证明,BAFF的异常表达不仅存在于上皮细胞及活化的T淋巴细胞,还存在于正常唾液腺分离出来的细胞及从干燥综合征患者唾液腺中分离出来的受B细胞浸润的唾液腺细胞[10].体外研究显示,用病毒或拮抗剂刺激Toll样受体可诱导干燥综合征唾液腺上皮细胞BAFF mRNA高表达,抑制IFN可抑制BAFF表达[11].双链RNA病毒和单链RNA病毒感染都可促进BAFF的表达,双链RNA主要促进树突样细胞的BAFF表达,单链RNA促进单核细胞和唾液腺上皮细胞的BAFF表达,而阻断单核细胞的IFN受体,可抑制BAFF表达[12].临床研究也发现,单核细胞表达IFN信号的患者亚群都具有较高的疾病活动指数及BAFF mRNA表达,阻碍IFN的表达或活性有望能使这类患者的病情得到改善[13],干燥综合征患者的单核细胞比健康对照者的单核细胞在受到IFN刺激后更容易促进BAFF的表达和分泌增加[4,14].

干燥综合征在中医古籍中并没有对应的病名,有医家认为按症、证当属"燥证"范畴,亦有医家认为其累及周身关节肌肉、关节疼痛、脏腑损害等而称为"周痹""痹证""脏腑痹"等.多数医家多遵从"燥盛则干"的病机理论,认为本病多因先天禀赋不足,阴津亏虚而发病,基本病机是血虚津亏.综合文献检索及临证经验,本研究认为燥痹初起即有燥毒存在,津伤日久,燥毒日盛,邪毒局部聚集,亦可成血瘀之弊,成燥瘀毒交杂之势,三者之间存在有机联系[15].活血解毒方以丹参为君,凉血活血,川芎助君活血之功;玄参解毒凉血清热,连翘清热解毒,生地、麦门冬、石斛、沙参生津;鸡血藤活血养血通络,生甘草调和诸药,诸药共奏活血解毒,养血生津之功能.本研究发现,经活血解毒方干预后,NOD小鼠血清及颌下腺中BAFF、BAFF-R水平及血清IFN-γ水平都有不同程度的降低.

由此可见,IFN-γ、BAFF、BAFF-R在干燥综合征的发病中起着重要的作用,IFN/BAFF/BAFF-R信号通路在调节B细胞稳态中起着重要的作用,以B细胞为靶点的治疗,也将成为治疗干燥综合征的一大突破点.目前中医药治疗干燥综合征的基础研究相对缺乏,IFN/BAFF/BAFF-R在干燥综合征发病及治疗中的作用也属于该领域近年来兴起的新方向,这是本研究的创新点所在.本研究的结果显示活血解毒方可减轻NOD小鼠颌下腺炎症,增加唾液分泌量,这一作用机制可能是通过干预IFN/BAFF/BAF-R信号通路而实现的,本研究的结果可为活血解毒方的作用机制提供一部分理论依据.

本研究仍有不足之处,本研究以NOD小鼠作为模型,有关研究发现,NOD小鼠的颌下腺浸润灶的淋巴细胞以T细胞为主,并且颌下腺组织表达的多种促炎性因子,可模拟临床干燥综合征表现.但因体积较小,血清及颌下腺标本取材较少,对进行更深入的研究造成一定困难,IFN/BAFF/BAFF-R上、下游的信号通路的影响以及活血解毒方对干燥综合征病灶中B细胞的作用还有待更进一步研究.

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(本文编辑:蒲晓田)

Effect of Huoxue Jiedu formula on IFN-γ and BAFF/BAFF-R in NOD mice with Sjögren's syndrome

SHI Yun-hui,LIU Yang,WEI Ni,et al. Graduate School of Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China
Corresponding author:ZHU Yue-lan,E-mail:zhuyuelanting@163.com

Objective To observe the effect of Huoxue Jiedu formula on BAFF/BAFF-R in NOD mice and explore the mechanism of Huoxue Jiedu formula to Sjögren's syndrome.Methods C57BL/6j mice and NOD/Ltj mice were used for research.The mice were intervened with water,total glucosides of peaony and Huoxue Jiedu formula respectively.The general status was observed.After 60 days of intervenation,the flow rate of saliva,index of submandibular gland,BAFF,BAFF-R and IFN-γ in serum and BAFF,BAFF-R in salivary gland were tested.Results One-way ANOVA was used for statistical analysis.When compared between two groups,LSD was used.The flow rate of saliva of the normal group was higher than other groups in every time point(P<0.05).Since the 40thday,the flow rates of saliva of control group and treatment group was higher than that in model group.There was no significant difference between control group and treatment group at that time(P>0.05).At the 60thday,the flow rate in treatment group was significantly higher than that in control group(P<0.05).The index of submandibular gland of the normal group was the highest(P<0.05)while that was the lowest of the model group (P<0.05).There was no significantly difference between the treatment group and control group (P>0.05).As for BAFF,BAFF-R and IFN-γ in serum and BAFF,BAFF-R in salivary gland,the normal group was the lowest(P<0.05),the model group was the highest(P<0.05),the treatment group was significantly lower than the control group(P<0.05).Conclusions Huoxue Jiedu formula can alleviate the inflammation of salivary gland,increase saliva and reduce BAFF,BAFF-R and IFN-γ in serum and BAFF, BAFF-R in salivary gland.

Sjögren's syndrome; B cell activating factor belonging to the TNF family; Interferon; Traditional Chinese medicine; Huoxue Jiedu

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.01.005

北京中医药大学校级自主课题(2014-JYBZZ-XS-147)

100029 北京中医药大学研究生院[史云晖(博士研究生)、柳洋(硕士研究生)];北京中医药大学东方医院风湿病科(韦尼、刘小平、朱跃兰)

史云晖(1989-),女,2013级在读博士研究生.研究方向:中医药治疗风湿免疫病.E-mail: syh890501@163.com

朱跃兰(1959-),女,博士,主任医师,博士生导师.研究方向:中医药治疗风湿免疫病.E-mail: zhuyuelanting@163.com

2015-06-22)