林地蘑菇ITS鉴定及生物学特性初步研究*

冯连荣　张　妍　梁德军　宋立志　矫丽曼　王胜东

（辽宁杨树研究所，盖州　115213）

林地蘑菇ITS鉴定及生物学特性初步研究*

冯连荣张妍梁德军宋立志矫丽曼王胜东**

（辽宁杨树研究所，盖州115213）

对采集的野生林地蘑菇子实体进行菌种分离后的研究结果表明，林地蘑菇分离株rDNA ITS片段长度为705bp，测序结果登录NCBI与GenBank中已知菌种进行BLAST比对，序列相似性在99%～91%之间，下载相似高的ITS序列，用Clustal W进行序列比对，MEGA 2.0软件构建系统树，结合形态特征，鉴定分离菌种为林地蘑菇纯菌种。生物学特性研究结果表明：适宜菌丝生长的碳源为可溶性淀粉，适宜的氮源为硫酸铵，适宜的无机盐为硫酸钙和磷酸二氢钾，菌丝最适温度为25～30℃。

林地蘑菇；ITS鉴定；生物学特性

林地蘑菇（Agaricus silvaticus）属伞菌目、蘑菇科、蘑菇属（Agaricus），在黑龙江、吉林、辽宁、江苏、浙江等地均有分布，夏秋季于针阔叶林中单生至群生。蘑菇属真菌在我国有着广泛分布，是选育栽培品种的重要对象，其中双孢蘑菇（A.bisporus）、双环蘑菇（A.bitorquis）、姬松茸（A.blazei）等更是世界范围的栽培种，在世界食用菌产业中占有非常重要的地位［1］。林地蘑菇作为一种可食用的野生食用菌，相对于上述广泛栽培的品种而言，相关研究还比较少。为了解林地蘑菇的特性，本研究采用组织分离法对采集的野生林地蘑菇子实体进行菌种分离，结合形态特征及分子生物学手段对菌种进行了鉴定，并对林地蘑菇菌丝生长所需的碳源、氮源、无机盐及培养温度等进行了初步研究，以期为林地蘑菇的开发利用奠定基础。

1　试验材料与方法

1.1试验材料

1.1.1子实体

林地蘑菇子实体于2012年采自原辽宁省杨树研究所小园内。

1.1.2培养基

PDA/PSA培养基：马铃薯200 g/L+葡萄糖/蔗糖20 g/L+琼脂18 g/L，pH值自然。

基础培养基：葡萄糖20 g/L+蛋白胨2 g/L+ MgSO4·7H2O 1 g/L+琼脂18 g/L，pH6.5。

1.1.3主要试剂及引物

TIANGEN DNA secure新型植物基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；PCR扩增试剂购自 Thermo；ITS分析所用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3'）/ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.2试验方法

1.2.1林地蘑菇形态鉴定及菌种分离

对采集的子实体进行形态鉴定，观察新鲜子实体的颜色、形状、着生方式及附属物等，测定菌盖和菌柄的大小，用显微镜对孢子形态特征进行观察。

采用组织分离法对林地蘑菇进行菌种分离。首先用70%酒精棉擦洗菌盖及菌柄部位进行表面消毒，在酒精灯火焰附近，用手将子实体从菌柄基部向菌盖处撕开，用燃烧后的手术刀片将菌盖与菌柄之间的菌肉切成小方块，然后用灭过菌的镊子夹取一小块菌肉组织，放入事先准备好的装有无菌培养基的PDA平板培养基中，置于25℃培养箱中黑暗培养。菌丝直径达到2 cm后，进行纯化培养，记为LD，培养好的菌种置于4℃冰箱中存放。

采用玻片培养法进行菌丝形态观察。用打孔器打取菌丝圆片，接种在培养皿中心位置，将处理好的盖玻片斜插到平板中，每皿插入两片，待菌丝长到盖玻片中央时，用镊子轻轻将盖玻片抽出，盖玻片中有菌丝的一面朝上，用显微镜观察。

1.2.2林地蘑菇的ITS鉴定

分离得到的菌种接种到PDA平板培养基中，25℃下静置暗光培养，待菌丝长满平板后，刮取菌落边缘的新鲜菌丝，使用 TIANGEN公司的DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取，具体操作方法按照说明书进行。提取的DNA溶于25 μL TE（pH8.0）中，-20℃保存备用。

以基因组DNA为模板，应用真菌通用引物对ITS1和ITS4进行PCR扩增，参照张妍等［2］的反应体系及反应程序进行。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送至宝生物工程（大连）有限公司进行测序。

1.2.3ITS序列分析与进化树构建

测序结果登录GenBank进行BLAST比对，找出与之最大相似性的序列，下载相似性序列的ITS区域，用Clustalw进行多序列比对，并辅以人工修正，分析时所有参数均为软件默认值。用MEGA 2.0软件采用NJ法构建系统发育树，进行系统发育分析。

1.2.4林地蘑菇生物学特性初步研究

1.2.4.1同步菌丝的制备

在超净工作台中，从分离的LD母种中挑取黄豆粒大小的菌丝块，接种到综合PDA平板培养基中央（培养皿直径为90 mm），置于25℃培养箱中避光培养，待菌丝快长满平皿时，用直径6 mm的打孔器在平板上靠近菌丝边缘相同直径的圆圈上打取菌丝块，保证试验所用菌丝块均为相同菌龄。

1.2.4.2菌丝生物学特性研究

碳源试验：分别用果糖、麦芽糖、可溶性淀粉代替PSA培养基中的蔗糖，制成含有不同碳源的培养基配方，观测不同碳源对菌丝生长的影响。

氮源试验：分别用酵母膏、尿素、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵代替基础培养基中的蛋白胨，制成含有不同氮源的培养基，观测不同氮源对菌丝生长的影响。

无机盐试验：分别用磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸钙代替基础培养基中的硫酸镁，制成含有不同无机盐的培养基，观测不同无机盐种类对菌丝生长的影响。

温度试验：以PDA为培养基，温度设置20、25、30、35℃，观测不同温度对菌丝生长的影响。

1.2.4.3测定方法

各试验处理菌种接种到平板培养基中央，每种处理重复5次，当其中一个处理菌丝长满培养皿时结束试验，每天测量菌丝饼直径，计算菌丝生长速度，同时观察菌丝长势、浓密度等生长指标。

2　结果分析

2.1林地蘑菇形态特征

子实体（图1-A）菌盖直径7.8 cm，扁半球形，近白色，覆有浅褐色鳞片。菌肉白色。菌褶初白色，渐变粉红色，后栗褐色至黑褐色，离生，稠密，不等长。菌柄长8.5 cm，粗0.8 cm，白色，基部略膨大。菌环白色，膜质，单层，生菌柄上部。孢子印黑褐色，孢子褐色（图1-B），光滑，椭圆形，基本符合《中国大型真菌》［3］对林地蘑菇的描述。子实体经组织分离后获得纯种菌丝，菌丝在PDA培养基上呈白色（图1-C）。显微镜下观察菌丝有隔，有索状联合（图1-D）。

图1　林地蘑菇形态特征

2.2菌丝DNA提取及ITS-PCR扩增

提取的DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测（图2-A），DNA条带清晰、较明亮，可以作为PCR反应的模板。以 DNA为模板，ITS1、ITS4为引物对rDNA ITS区段PCR扩增结果显示，片段大小约为700 bp左右（图2-B）。

2.3序列相似性搜索及进化树构建

rDNA ITS区段序列测定结果显示，PCR扩增产物长度为705bp。测序结果登录GenBank核酸序列数据库进行Blastn搜索，与登录号JF797178.1 （A.silvaticus）的菌种覆盖度最高达100%，相似性达99%。得到的序列相似性在99%～91%之间，全部为蘑菇属的不同种。下载相似高的ITS序列，用Clustal W进行序列比对，并辅以人工修正后，基于分离株以及来自GenBank的最相似蘑菇属16个种的ITS序列，用MEGA 2.0软件采用NJ法构建系统树（采用默认值，图3）。从系统树可看出，LD中的菌种与蘑菇属中的林地蘑菇聚为一支，结合形态特征，鉴定分离菌种为林地蘑菇纯菌种。

图2　林地蘑菇DNA琼脂糖凝胶及PCR扩增电泳图

图3　林地蘑菇及来自GenBank的组相似物种的ITS序列构建的NJ系统发育树

2.4菌丝的生物学特性

2.4.1不同碳源对菌丝生长的影响

4种碳源均可以被林地蘑菇菌丝所利用（表1），其中以可溶性淀粉作为碳源时菌丝长势最强，菌丝健壮而浓密，与其他碳源相比差异显著。其次是蔗糖、麦芽糖和果糖，三者对菌丝生长速度的影响差异不显著，但果糖菌丝致密程度不如麦芽糖和蔗糖。

表1　不同碳源对林地蘑菇菌丝生长及生长势的影响

2.4.2不同氮源对菌丝生长的影响

菌丝在硫酸铵为氮源的培养基上生长快而健壮，菌丝浓密，与其他氮源培养基上的菌丝生长速度差异显著；其次是以蛋白胨作为氮源的培养基菌丝生长较好；而以尿素为氮源时，菌丝不能生长（表2）。可见，进行林地蘑菇菌丝培养时宜选择硫酸铵作为氮源，尿素不宜选用。

表2　不同氮源对林地蘑菇菌丝生长及生长势的影响

2.4.3不同无机盐对菌丝生长的影响

不同的无机盐对林地蘑菇菌丝生长具有一定的影响，在添加硫酸钙和磷酸二氢钾的培养基中，菌丝生长速度快，菌丝健壮而浓密；添加硫酸镁的培养基中菌丝生长速度与硫酸钙和磷酸二氢钾相比差异显著，菌丝生长较健壮但菌丝较稀；添加氯化钠后菌丝长势一般（表3）。

表3　不同无机盐对林地蘑菇菌丝生长及生长势的影响

2.4.4不同温度对菌丝生长的影响

林地蘑菇菌丝在20～30℃范围内可以生长，随着温度上升，菌丝生长速度逐渐加快；当温度超过35℃以后菌丝不能生长。试验表明，林地蘑菇菌丝生长的适宜温度为25～30℃（表4）。

表4　不同温度对林地蘑菇菌丝生长及生长势的影响

3　结论与讨论

3.1ITS是核糖体rDNA中介于18S与5.8S之间、5.8S与28S之间的内部转录间隔区，其保守性表现为种内相对一致，种间高度特异［4］。ITS序列通过与GenBank数据库进行BLAST检索比对，序列相似性≥99%，可以鉴别为相同种；序列相似性为95%～99%，可以鉴别为相同属［5］。该方法在大型真菌属内种间及种群分类研究中应用日益广泛［6-7］。本研究对采集的野生林地蘑菇进行了菌种分离，并结合子实体、菌丝、孢子等形态特征，辅以rDNA ITS序列的比较分析及NJ法系统发育树的构建，鉴定了所分离的菌种为林地蘑菇纯种菌丝。

3.2本研究利用单因素试验确定了林地蘑菇培养阶段适宜的碳源为可溶性淀粉，这与胡润芳的研究结果一致；适宜的氮源为硫酸铵，不宜选用的氮源为尿素；适宜的无机盐为硫酸钙和磷酸二氢钾；适宜培养温度为25～30℃，与双孢蘑菇［8］、大肥菇［9］等蘑菇属真菌相似。本研究只是进行了林地蘑菇生物学特性的初步研究，对于各因素之间有无交互作用，如何组合还需要进一步研究。

［1］李荣春.蘑菇属不同种类、不同品种在不同培养基上的菌丝生长观察［J］.中国食用菌，2000，19（增刊）:136-138.

［2］张妍，冯连荣，王克翰，等.卷边桩菇组织分离与ITS序列分子鉴定［J］.林业科技通讯，2016（5）:8-11.

［3］卯晓岚.中国大型真菌［M］.郑州:河南科学技术出版社，2000.

［4］高磊.新疆南疆野生双胞蘑菇的鉴定、生物学特性及其驯化栽培的研究［D］.塔里木:塔里木大学，2012.

［5］Renske L，Paula L，Thom W K，et al.Molecular Identification of Ectomycorrhizal Mycelium in Soil Horizons［J］.Applied and Environmental Microbiology，2003，69（1）:327-333.

［6］高山，胡平，边银丙，等.基于ITS序列对3个侧耳菌种的分子鉴定［J］.湖北农业科学，2008，47（12）:1390-1393.

［7］张微思，罗孝坤，张丽英，等.松茸菌丝体的纯培养及其鉴定［J］.中国食用菌，2010，29（3）:34-36.

［8］侯志江，李荣春.蘑菇属主栽种栽培特性比较及驯化展望［J］.云南农业大学学报，2009，24（3）:474-478.

［9］丁湖光.大肥菇生物特性及高产栽培［J］.特种经济动植物，2006，9（8）:36.

第1作者简介：冯连荣（1983-），女，博士研究生，工程师，主要从事食用菌栽培及杨树转基因育种研究。

（责任编辑：王岳）

Preliminary Study on ITS Sequence and Biological Characteristics of Agaricus silvaticus

FENGLianrong
（Liaoning Institue of Poplar，Gaizhou115213）

The species were identified by morphological characteristics and molecular biological methods. The results showed amplified by PCR of tissue isolates ITS rDNA fragment of Agaricus silvaticus.the length of the amplified product was 705bp，compared with the known species of GenBank and Blastn in NCBI，sequence similarity is between 99%～91%，download ITS sequences of strains with high similarity，sequence alignment by Clustal W，construct phylogenetic tree by MEGA2.0，By tree graph analysis，Identification of isolates is Agaricus silvaticus pure strains.The results showed that the suitable carbon source for mycelium growth was soluble starch.The nitrogen source suitable was ammonium sulfate，the suitable inorganic salt was calcium sulfate and potassium dihydrogen phosphate，the suitable temperature was 25～30℃.

Agaricus silvaticus；ITS sequence；Biological characteristics

S664.4

C

1001-9499（2016）04-0020-04

*辽宁省农业攻关及成果产业化项目（201420701）资助

王胜东（1966-），教授级高级工程师。

2016-06-30