火麻仁薄层色谱鉴别用对照提取物的研制与应用*

邓仕任，蔡明宸，夏林波，王　鑫，朱夏敏

(辽宁中医药大学药学院，辽宁　大连　116600)



火麻仁薄层色谱鉴别用对照提取物的研制与应用*

邓仕任，蔡明宸，夏林波，王鑫，朱夏敏

(辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600)

研制被薄层色谱鉴别用火麻仁对照提取物，以替代对照药材用于火麻仁的薄层鉴别。从制备工艺考察、提取物稳定性影响因素考察以及提取物性状等方面制订薄层色谱鉴别用火麻仁对照提取物的制备和保存方法，并比较对照药材与对照提取物在薄层鉴别中的应用结果。结果表明：制备方法为：火麻仁药材粉末(过二号筛)加25倍乙醚脱脂后，药渣加10倍甲醇加热回流提取1 h，滤过，减压蒸去甲醇，所得浸膏用10倍甲醇复溶，加入与浸膏等重量的柱层析硅胶(200～300目)，混匀，减压蒸干甲醇，过九号筛即得。该对照提取物与火麻仁药材的薄层鉴别效果一致。本研究制备的火麻仁薄层鉴别用对照提取物稳定可靠，可以替代火麻仁对照药材用于火麻仁及其成方制剂的质量控制分析。

火麻仁；薄层色谱鉴别；对照提取物；质量控制

对照提取物是2005版《中国药典》首次增加的一类新的中药标准物质，2010版《中国药典》已增加至16个品种的药材对照提取物和挥发油对照提取物[1]。以对照提取物作为标准物质对于控制中药的质量具有如下优点[2-3]：(1)与化学对照品比较，分离难度小容易获得，且价格低廉，相当于同时采用多个化学对照品进行鉴别，提高了鉴别的专属性；(2)与对照药材相比较，它具有良好的均匀性与稳定性，能直接溶于有机溶剂配制成供检测用的标准物质，与对照药材提取过程繁琐耗时相比，它简便快捷，提高了药检部门的检测效率。在2010版《中国药典》中，对照提取物在中药的质量控制方面主要用于成方制剂，而在药材与饮片的质量标准中使用较少，目前仅有巴戟天、肉豆蔻、川芎等[4-6]少数药材被报道制备成薄层色谱用对照提取物。目前，火麻仁药材薄层鉴别用参照物仍为火麻仁对照药材，但由于火麻仁中含有大量的脂肪油，在贮藏过程中易发生复杂的化学变化，产生游离脂肪酸、过氧化物和低分子醛、酮类等分解产物，影响对照药材的稳定性和质量[7-8]；此外，薄层鉴别时，尚需要将火麻仁对照药材经过回流脱脂、过滤、回流提取等流程，方能得到对照药材储备液，过程繁琐，因而亟需开发一种更稳定、更方便的火麻仁薄层鉴别用对照物质。本研究在2015年版中国药典科研立项的资助下，依照国家药典委员会《国家药品标准物质研制技术要求》的相关规定，制备了一种火麻仁薄层用对照提取物，并考察了该对照提取物替代对照药材的可行性。

1　仪器与试药

AY220电子分析天平，日本岛津；DZF-6021真空干燥箱，苏州江东精密仪器有限公司；PQX-330A-12H智能人工气候箱，宁波莱福科技有限公司；CHRIST真空冷冻干燥机，德国产；HC-2518R高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；DZF-6021真空干燥箱，苏州江东精密仪器有限公司；RE52CS旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；FW-100高速万能粉碎机，北京市永光明医疗仪器厂；UVmini-1240型紫外可见分光光度计，日本岛津；数显HH-4恒温水浴锅，国华电器有限公司；KQ2200型超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司；101型电热鼓风干燥箱，北京市永光明医疗仪器厂。

甲醇(分析纯)、乙腈(色谱纯)，天津市大茂化学试剂厂；水为娃哈哈纯净水。

三批次火麻仁药材分别产自河北、广西、贵州。经辽宁中医药大学鉴定教研室翟延君教授鉴定均为桑科植物大麻CannabissativaL.的干燥成熟果实。火麻仁对照药材购自中国食品药品检定研究院(批号为121097-201104)。

2　方法与结果

2.1制备方法考察

以药典记载的火麻仁对照药材的提取方法(取本品粉末 2 g，加乙醚50 mL，加热回流1 h，滤过，药渣再加乙醚20 mL洗涤，弃去乙醚液，药渣加甲醇30 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液)为基础，重点考察火麻仁经乙醚脱脂后，甲醇回流提取过程中的相关工艺。

2.1.1粉碎粒度的考察

对粉碎粒度进行单因素考察，以提取物的过筛率和浸膏得率做为指标，结果如表1所示。

表1　粉碎粒度和过筛率考察

由表1可知，药材的粉碎粒度越细，浸膏得率越高；但我们同时还发现，随着筛板目数的增加，药材的过筛率急剧下降。其主要原因在于，火麻仁药材的含油量特别高(可达30%)，如果长时间过度粉碎，则油脂会大量析出，形成稠膏状固体，难以过筛；因此粉碎时间和强度都不宜过高，故而药材粒度较大，只能在20目筛时有较高的过筛率。

此外，在过40目筛时，我们还发现，没有过筛的基本都是火麻仁的果皮和种皮部分，而种仁部分则可全部过筛。因此如果采用40目筛，则会人为改变药材的原始组成和成分。

综上，我们最终将粉碎粒度定为20目。

2.1.2提取溶剂种类的考察

考察不同溶剂对浸膏得率的影响，由表2结果可知，甲醇提取率较高，故选用甲醇。

表2　提取溶剂考察

2.1.3提取条件的优化

分别考察料液比、提取次数和提取时间对浸膏得率的影响，结果见表3。可见选择料液比(药材:甲醇，V:V)为 1:10时，提取1次，每次1 h时，提取率较高，且经济合理。

表3　提取条件的考察

2.1.4硅胶加入量的考察

脱脂后的火麻仁药材经甲醇提取，所得浸膏呈粘稠状胶质物。经真空干燥不能得到固体粉末，经冷冻干燥虽能成粉末，但极易吸湿，暴露在空气中，1 min内即由粉末团聚成黏胶状物质，无法保存。所得胶状浸膏经甲醇/乙醇反复醇沉数次，可得到胶质较少的粉末状提取物，但得率太低(低于0.2%)，无制备意义。

基于上述情况，我们最终选择了以硅胶吸附拌样的方式制备提取物粉末。我们选用了常见的柱层析硅胶(200～300目)，考察了提取物浸膏与硅胶用量比，结果见表4。可见，当硅胶用量太少(2:1)时，吸附不完全，提取物不能成粉末状，仍未粘稠胶状物；硅胶用量太大(1:2)，死吸附在硅胶上的物质太多，造成提取物溶出率降低。综合上述结果，我们认为提取物浸膏与硅胶用量比为1:1是比较合适的，此时提取物能完全吸附于硅胶颗粒上，且加甲醇溶解时，溶出率也较高。

表4　硅胶加入量考察

*溶出率=可溶解在甲醇中的提取物质量/吸附于硅胶上的提取物质量。

2.2最终制备方法

取火麻仁药材粉末(过二号筛)200 g，加乙醚5000 mL，加热回流1 h，滤过，药渣再加乙醚2000 mL洗涤，弃去乙醚液，药渣加甲醇2000 mL，加热回流1 h，滤过，减压蒸干甲醇，得浸膏，称重，应为9～10 g。浸膏用100 mL甲醇复溶，加入与浸膏等重量的柱层析硅胶(200～300目)，混匀，减压蒸干甲醇，过九号筛，即得。

所得提取物为黄绿色至绿色粉末，气微香，具吸湿性，得率应为7%～9%。

2.3对照提取物替代对照药材的可行性验证

取火麻仁对照提取物粉末0.2 g，加甲醇1 mL，超声处理2 min，离心，上清液作为供试品溶液。另取火麻仁对照药材2 g，加乙醚50 mL，加热回流1 h，滤过，药渣再加乙醚20 mL洗涤，弃去乙醚液，药渣加甲醇30 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5～10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(15:1:0.3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛乙醇溶液-硫酸(1:1)混合溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果见图1。可见，对照提取物与对照药材在TLC色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，证明所制备的火麻仁对照提取物替代火麻仁对照药材是完全可行的。

图1　火麻仁对照药材及3批不同产地火麻仁药材制成的对照提取物的TLC图

2.4火麻仁对照提取物的稳定性测试

按照国家药典委员会制订的“国家药品标准物质研制技术要求”的相关规定，以性状、溶解性、TLC图谱稳定性等为指标，考察火麻仁对照提取物在高温、高湿和强光照射下的稳定性，为药品的生产、包装、贮存、运输条件提供科学依据。

2.4.1高温度试验

供试品开口置适宜的洁净容器中，60 ℃温度下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目进行检测。若60 ℃无明显变化，则不再进行40 ℃试验。

结果表明，在60 ℃温度下，对照提取物经10天放置后溶出率无明显变化，此外，提取物性状和TLC行为也与高温试验前无明显变化。

2.4.2高湿度试验

供试品开口置恒湿密闭容器中，在25 ℃于相对湿度90%±5%条下放置10天，要求吸湿增重不得超过5%，否则应考察相对湿度75%±5%下的稳定性。

结果在相对湿度90%条件下，样品吸湿高达30%～40%，不符合要求，因此我们将再样品置于相对湿度75%±5%条件下考察稳定性。样品在25 ℃于相对湿度75%±5%条下放置10天，于第5天和第10天分别取样，按稳定性重点考察项目要求检测，同时准确称量试验前后供试品的重量，以考察供试品的吸湿潮解性能。结果表明，提取物性状与高湿度试验前有所变化，虽粉末颜色无明显变化，但稍有结块现象，且在高湿度环境下(相对湿度75%±5%)，粉末吸湿较明显(第10天吸湿增重可达11%～16%)。此外，提取物溶出率和TLC行为均与高湿试验前无明显变化。

2.4.3强光照射试验

供试品开口放在装有日光灯的光照箱或其他适宜的光照装置内，于照度为4500 lx±500 lx的条件下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目进行检测，特别要注意供试品的外观变化。

结果表明，提取物性状、溶出率及TLC行为均与强光照射试验前无明显变化。

3　结　论

(1) 本制备方法提供一种火麻仁对照提取物的制备方法，与常规提取物一般为经溶剂提取制成的干燥浸膏的传统方法不同，由于火麻仁对照提取物直接干燥后得到的浸膏吸湿现象非常严重，暴露在空气中约1 min即会吸湿成液态，不符合对照提取物研制要求中的稳定性要求，无制备意义。由此本制备方法首次采用了硅胶拌样的方法，通过考察了提取物浸膏与硅胶用量比，我们认为提取物浸膏与硅胶用量比为1:1是比较合适的。硅胶拌样法使火麻仁对照提取物均匀吸附于硅胶上，降低了火麻仁对照提取物的吸湿性，大大增强了其均匀性和稳定性，最终得到了符合《国家药品标准物质研制技术要求》的粉末状对照提取物。

(2)稳定性影响因素实验结果表明，3批火麻仁对照提取物供试品在高温和强光条件下比较稳定均未见变色、黏连、结块和吸潮现象，而在高湿度条件下吸湿比较严重，因此建议，本品应密闭，置干燥处保存。

(3)火麻仁对照提取物具有配制方便、性质稳定、均匀性良好、便于称量、贮存等特点，薄层色谱结果表明，此对照提取物可代替火麻仁对照药材作为处方中含有火麻仁的中药薄层鉴别用对照物质。

(4) 对照提取物虽然具有很多使用方便等优点，但是也有其自身缺点，如品种少，无明确的规范和标准，怎么保证对照提取物的均一性和稳定性等问题亟待解决。供薄层鉴别使用的对照提取物药材来源需要进行质控，以保证评价的客观性。在标定和保证稳定性方面，可引入指纹图谱技术对其标定，指纹图谱技术可客观地反映对照提取物的质量全貌，可确保不同批次对照提取物质量稳定均一，也可在以后研究过程中深入有效部位、饮片、以及复方制剂三方面对照提取物的研究，以补充中药标准物质，提高质控标准。

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[M]．北京：化学工业出版社，2010：370．

[2]张潮林，徐文杰，沈雪梅．《中国药典》2005年版中药对照品的应用[J]．齐鲁药事，2007，26 (1)：29-33．

[3]陆兔林，翟为民，蔡宝昌，等．对照提取物在中药质量控制中的应用[J]．中国中药杂志，2013，38(3)：462-465．

[4]林锦锋，杨志业，李曼莎，等．巴戟天薄层色谱鉴别用对照提取物的研制与应用[J]．中国医药导报，2015(27)：22-25．

[5]杨志业，李曼莎，林锦锋，等．肉豆蔻薄层色谱用对照提取物的制备与应用研究[J]．药物分析杂志，2015(7):1283-1286．

[6]吕维．川芎薄层鉴别用对照提取物的研究[D]．成都：成都中医药大学，2014．

[7]朱江， 蔡明宸，王鑫，等．非水反相色谱法测定火麻仁中甘油三酯含量[J]．中国实验方剂学杂志，2015(13)：53-55．

[8]邓仕任，夏林波，郭莹．响应面法优化超声波提取火麻仁油[J]．食品工业科技，2012(5)：243-245．

Study on the Preparation and Application of Cannabis Fructus TLC Reference Extract

DENGShi-ren,CAIMin-chen,XIALin-bo,WANGXin,ZHUXia-min

(College of Medicine, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Liaoning Dalian 116600, China)

Cannabis fructus TLC reference extract was prepared and its application in the quality control of Cannabis fructus and preparations as a reference drug was explored. Cannabis fructus TLC reference extract was prepared by opting processing route and investigating stability influencing factors. The application to TLC identification items of Cannabis fructus was performed according to the Chinese Pharmacopoeia 2010 edition. Results showed that Cannabis fructus TLC reference extract can play the same role as Cannabis fructus reference drug with the same quantity and quality. Cannabis fructus TLC reference extract for TLC identification can be used for quality control analysis of Cannabis fructus and preparations. The research provided a foundation for further development of TCM reference extracts.

Cannabis fructus; TLC identification; reference extract; quality control

2015年版中国药典一部科研立项(火麻仁药材及饮片)；辽宁省高等学校优秀人才支持计划(LJQ2015070)；全国中药饮片炮制规范(第二批)研究任务(2015-YP-24)。

邓仕任(1979-)，男，博士，副教授。

夏林波(1977-)，女，博士，副教授。研究方向为中药中药分析。

R284.1

A

1001-9677(2016)05-0071-03