UPLCMSMS法测定动物源性食品中盐酸多巴胺

虞太六

(上海天祥质量技术服务有限公司，上海　200233)



UPLCMSMS法测定动物源性食品中盐酸多巴胺

虞太六

(上海天祥质量技术服务有限公司，上海200233)

建立动物源性食品中多巴胺的超高效液相色谱-质谱/质谱法(UPLCMSMS)。动物源性样品中的残留物经酶解，用高氯酸调节pH值，沉淀蛋白离心，上清液用异丙醇-乙酸乙酯提取，再用阳离子交换柱净化，液相色谱-质谱/质谱测定，内标法定量。多巴胺的检出限为0.1μg/L；在浓度在0.5～10μg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数为0.998；方法平均回收率在85%以上，相对标准偏差均小于10%。该方法有准确、快速和灵敏度高的特点，适合于动物源性食品中的痕量多巴胺的快速测定。

多巴胺；超高效液相质谱联用；动物源性食品

多巴胺为儿茶酚类神经传递物质，具有重要的生理功能以及广泛的临床应用价值。很多的科研工作者越来越注重对多巴胺的深入研究[1-3]，而选择可靠易行的分析方法是得到准确结果的前提。目前，常用的多巴胺检测方法有荧光法、放射酶学法、电化学分析法和高效液相色谱法。这些方法也各有其特点，但都有一定的缺点和局限性。荧光法灵敏度不够[4]；放射酶法检测速度慢；电化学法灵敏度高但方法复杂[5]；HPLC法灵敏度虽然不高，但还需要专门配备荧光检测器或电化学检测器[6]，所以，它们在灵敏度、选择性及分析速度方面很难满足食品分析要求，不能在食品检测行业得以广泛推广。

随着人们生活水平的提高，人们对食品安全的要求也越来越高，开始越来越关注动物源性食品中存在的多巴胺给人们身体健康带来的影响，在北京奥运会期间，我国也将多巴胺作为动物源性食品质量控制指标，所以开发出动物源性食品中多巴胺的检测方法具有很强的现实意义。超高效液相质谱联用作为多巴胺重要手段之一，能够满足快速对痕量和超痕量多巴胺进行分析，对于食品检测、临床诊断和基础研究具有重大意义。本研究采用UPLC-MS/MS检测动物源性食品中的多巴胺的含量。

1　实　验

1.1材料与仪器

甲醇(色谱纯)，甲酸(分析纯)，乙酸钠(分析纯)，高氯酸(分析纯)，氢氧化钠(分析纯)，氯化钠(分析纯)，异丙醇(色谱纯)，乙酸乙酯(色谱纯)，氨水(分析纯)，超纯水，盐酸多巴胺标准品(98.6%)，沙丁氨醇-D3标准品(100μg/mL)。

Agilent1290超高效液相色谱-串联AB4500质谱仪，美国Agilent和ABSCIEX公司；电子分析天平，瑞士梅特勒托利多公司；恒温振荡水浴；冷冻离心机；振荡器；pH计；氮吹仪；SPE固相萃取装置；涡旋混合器。

1.2实验方法

1.2.1标准工作溶液的配置

准确称取盐酸多巴胺标准品10.0mg于50mLA级容量瓶中，用甲醇溶解并定容到，混匀，即得浓度为200μg/mL多巴胺标准储备液。从标准储备液中各吸取0.025mL至50mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀，即得浓度为100μg/L标准中间液。再从标准中间液中吸取10mL至50mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀，即得浓度为20.0μg/L备用储备液。

用A级单标线移液管准确吸取内标沙丁胺醇-D3(100μg/mL)0.5mL于50mL容量瓶中，用甲醇定容到50mL，混匀，即得浓度为1.0μg/mL沙丁胺醇-D3标准储备液。从标准储备液中吸取2mL至50mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀，即得浓度为40.0μg/L内标备用储备液。

从标准备用储备液中分别吸取0.25mL、0.5mL、1.0mL、2.5mL、5.0mL至10mL容量瓶中，再从内标储备液中各吸取0.62mL至10mL容量瓶中，用0.1%甲酸水溶液-甲醇(95:5)定容，混匀，浓度均为0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L，内标浓度均为2.5μg/L。标准工作液现配现用。

1.2.2样品溶液制备

准确称取5g(精确到0.01g)样品于50mL离心管中，加入40μg/L内标溶液0.62mL，加入0.2mol/L乙酸钠缓冲溶液(pH=5.2)10mL，充分混匀，再加入0.05mLβ-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶，混匀后，37 ℃酶解16h。取出后于振荡器上振荡15min，4000r/min离心10min，取5mL上清液，加入0.1mol/L高氯酸溶液5mL，混合均匀，用高氯酸调节pH值至1±0.3。4000r/min离心10min后，将全部上清液转移至50mL离心管中，用10mol/L氢氧化钠调节pH值至11±0.3，加入10mL饱和氯化钠溶液和10mL异丙醇-乙酸乙酯(6:4)混合溶液，充分提取，4000r/min离心10min。 转移全部有机相，40 ℃水浴氮吹至干。加入5mL0.2mol/L乙酸钠缓冲溶液(pH=5.2)，超声混匀，溶解残渣，待净化。

将上述溶解过已活化的阳离子交换小柱(用3mL甲醇、3mL水活化)，再依次用2mL水、2mL2%甲酸水溶液和2mL甲醇淋洗，最后用2mL5%氨化甲醇洗脱，洗脱液于40 ℃水浴氮吹至干。 准确加入0.5mL甲醇-0.1%甲酸水(5:95)，混匀。过膜，供LC-MS-MS分析。

1.2.3仪器条件

1.2.3.1色谱条件

色谱柱：C18柱(100mm×2.1mm，1.8μm)或相当者；

流动相：A相为：0.1%甲酸水溶液，B相：甲醇；

流速：0.3mL/min；

进样量：20μL；

柱温：30 ℃。

表1　较佳洗脱程序Table 1　Optimal elution condition

1.2.3.2质谱条件

离子源：电喷雾ESI离子源，扫描方式：正离子扫描，检测方式:MRM， 电喷雾电压：5500V，雾化气压力：50psi，气帘气压力：35psi，辅助气压力：50psi， 碰撞气压力：9psi，离子源温度：500 ℃， 碰撞时入口电压：10V，碰撞时出口电压：6V。

表2　多巴胺及内标质谱参数Table 2　MRM for Dopamine and Internal Standard

2　结果与讨论

2.1液相条件优化

分别考察了常用的有机相甲醇、乙腈、甲酸水溶液和纯水等组配的流动相体系对多巴胺及内标物离子化及分离度的影响。结果表明，以0.1%的甲酸水和甲醇做为流动相获得了最优的色谱分立效果和质谱信号响应。由于多巴胺是正离子扫描模式，故在流动相中加入少量的甲酸，促进多巴胺的保留性能，又有利于获得较好的分离和峰型。通过优化梯度洗脱条件，多巴胺及内标物在8分钟内出峰。

2.2标准曲线、线性范围及方法检出限

用0.1%甲酸水溶液-甲醇(95:5)配制浓度为0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L，内标浓度均为2.5μg/L的标准曲线。在选定的流动相和质谱参数下测定，以质量浓度为横坐标，其相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。得到其线性方程为y=0.39057x+0.01432及其相关系数(r)为0.998，如图1所示。多巴胺在浓度在0.5～10μg/L范围内具有良好的线性关系。根据信噪比S/N=3估算仪器检出限，再根据前处理稀释倍数计算出方法检出限(LOD)，多巴胺的检出限为0.1μg/L。

图1　多巴胺的标准曲线

2.3方法的回收率和精密度

采用经测定不含多巴胺的猪肉、猪肝和羊肉空白样品，分别添加0.5μg/L，2μg/L，10μg/L三个水平的标准储备液及内标溶液。按照1.2.2方法步骤处理样品，同一样品进行6次平行测定，分析测定并计算回收率和精密度，测得平均回收率在85%～102%之间，标准偏差均小于10%，如表3所示。

表3　基质加标的回收率和精密度(n=6)Table 3　Recovery and RSD of Spiked Matrix

3　结　论

本文建立动物源性食品中多巴胺测定的超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法，与高效液相色谱法相比，超高效液相色谱分析速度快，质谱检测灵敏度高、定性准确，三重四极杆选择性高，因而抗干扰性强，适合于动物源性食品中痕量的多巴胺的定性鉴别及定量测定。

[1]SPENCERJP,JENNERP,DANIELSE,etal.Conjugatesofcat-echolamineswithcysteineandGSHinParkinson’sdisease:possiblemechanismofformationinvolvingreactiveoxygenspecies[J].Neurochem,1998,71(5):2112-2117.

[2]LIUH,IACONORP,SCHOONENBERGT,etal.AcomparativestudyonneurochemistryofcerebrospinalfluidinadvancedParkinson’sdisease[J].NeurobiolDis, 1999,6(1):35-42.

[3]LEWITTPA,GALLOWAYMP,MATSONW,etal.MarkersofdopaminemetabolisminParkinson’sdisease.TheParkinsonstudygroup[J].Neurology, 1992,42(11):2111-2117.

[4]童裳伦,朱岩,杨景和. 稀土离子荧光探针对肾上腺素的测定[J]. 分析化学,2000,10(3): 293-295.

[5]ZHAOH,ZHANGY,YUANZ.Electrochemicaldeterminationofdopamineusingapoly(2-picolinicacid)modifiedglassycarbonelectrode[J].Analyst,2001, 126(3): 358-360.

[6]乔坤云, 高继玲. 高效液相色谱法测定尿液中儿茶酚胺类物质[J]分析科学学报, 2005, 21(2):219-220.

Determination of Dopamine in Animal-derived Foods by UPLCMSMS

YU Tai-liu

(Shanghai Intertek Testing Services Ltd., Shanghai 200233, China)

AnanalyticalmethodbasedonUPLC-MS/MSwasestablishedforthedeterminationofdopamineinanimal-derivedfoods.Theresiduesofanimal-derivedfoodswereenzymatichydrolysis.AdjustedthepHvalueandprecipitateproteinbyperchloricacid,theextractionwascentrifugedbycentrifuge.Thetopextractionwasextractedbyisopropanolandaceticetherandcleaned-upbySPEcolumn.Theextractionwasconfirmedbymassspectrumandquantifiedbyinternalstandardmethod.TheMDLofdopaminewas0.1μg/L.Therewasgoodlinearitybetween0.5～10μg/Lwithgoodcorrelationcoefficientsof0.998.Therecoveryofthemethodwasabove85%andRSDwasbelow10%.Themethoddevelopedisaccurate,fastandsensitive,canbeusedtoconfirmandquantifydopamine.

dopamine;UPLC-MS/MS;animal-derivedfood

O657

A

1001-9677(2016)013-0134-03