肉桂水煎液对肝微粒体细胞色素P450酶的影响

孟永海，王欣慰，史连宏，康天济，陈忠新，李　冀，翟春梅

（1.黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，哈尔滨150040；2.黑龙江中医药大学北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室，哈尔滨150040；3.黑龙江中医药大学基础医学院，哈尔滨150040）

肉桂水煎液对肝微粒体细胞色素P450酶的影响

孟永海1，2，王欣慰1，2，史连宏1，2，康天济1，陈忠新1，李冀3，翟春梅1，2

（1.黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，哈尔滨150040；2.黑龙江中医药大学北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室，哈尔滨150040；3.黑龙江中医药大学基础医学院，哈尔滨150040）

考察肉桂水煎液对肝微粒体细胞色素P450酶CYP1A2和CYP2E1活性的影响.采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）对大鼠肝脏细胞色素P450酶CYP1A2和CYP2E1进行了初步研究.与空白对照组比较，肉桂水煎液对大鼠肝脏中的CYP1A2和CYP2E1含量有增加的趋势.肉桂水煎液对大鼠肝微粒体CYP1A2和CYP2E1活性有诱导作用，临床上当与经过CYP1A2和CYP2E1代谢的药物合用时应该注意药物间的相互作用.

肉桂；抗体夹心酶联免疫吸附法；CYP450酶；CYP1A2；CYP2E1

肉桂，为樟科植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl）的干燥树皮.多于秋季剥取，阴干.肉桂味辛、甘，性大热，归肾、脾、心、肝经.具有有补火助阳，引火归元，散寒止痛，温通经脉的功效［1］.主治阳痿宫冷，腰膝冷痛，肾虚作喘，虚阳上浮，眩晕目赤，心腹冷痛，虚寒吐泻，寒疝腹痛，痛经经闭等症.肉桂药用历史非常悠久，早在《太平惠民和剂局方》记载含有肉桂的“十全大补汤”、“人参养营汤”、“苏子降气汤”及“五积散”等经典方剂.肉桂药理作用很多，主要对消化系统、免疫系统、心血管系统有抗菌、抗肿瘤及镇痛等作用.也有报道称，肉桂有调节血压、抗氧化、解热、驱虫作用.在食品方面常用作香料、保鲜剂等［2］.过去肉桂多集中于中医复方使用，然而现代临床使用肉桂治疗疾病时也经常与化学药品配合使用，肉桂中的成分与临床西药是否产生药物的相互作用，是否产生毒副作用，目前研究较少，没有明确的实验依据.人们公认中药中的化学成分对人体产生其作用与肝中细胞色素P450酶具有直接关系.因此，为了探讨肉桂与人体的整体作用机制和特点，本实验考察肉桂水煎液对肝微粒体细胞色素P450酶CYP1A2和CYP2E1活性的影响，为指导肉桂临床合理用药和减少毒副作用产生的可能性提供必要的实验基础.

1　实验材料

1.1实验药材

肉桂购自哈尔滨世一堂药店，经黑龙江中医药大学药学院王振月教授鉴定均符合《中国药典》规定.

1.2实验动物

雌性SD大鼠20只，体重（220±20）g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心，合格证号：SCXK 黑2013004.动物饲养过程中保持室内温度18～22℃，室内昼夜自然明暗交替照明，饲养标准大鼠饲料.

1.3实验仪器

离心机（MIKRO 220R，Hettich），-80℃冰箱（900 SERIES，Thermo），酶标仪（VICTORTMX3，PerkinElmer）.双蒸水（Milli-Q），移液枪（DRAGON MED），精密恒温培养箱（BPH-9162型，上海一恒科技有限公司）.

2　材料与方法

2.1肉桂水煎液的制备

按临床常用方法对药物进行处理.称取定量的上述药材，加入10倍量水，浸泡60 min，快速加热至沸腾，煎煮60 min，倾出药液，残渣再加入8倍水，煎煮提取60 min.合并2次药液，过滤，石膏浓缩至含生药量为21.6 g/mL中药水提液，4℃储存备用.

2.2实验动物分组及给药

将大鼠随机分为2组，空白对照组、肉桂水煎液组，大鼠适应7 d后，每天分别按给药容积为20 mL/kg体重灌胃给予含5%羧甲基纤维素钠的肉桂水煎液.连续15 d，各组饲养过程中保持温度、光照、湿度等环境条件均衡，自由进食饮水.

2.3肝指数的测定

各给药组大鼠连续给药15 d后，大鼠末次给药后开始禁食，12 h后处死，取出肝脏，称量各组大鼠的体重及肝脏质量，计算肝指数=大鼠肝脏质量/大鼠体重×100%.

2.4肝脏微粒体的制备

肝脏微粒体的制备采用超速离心法制备，大鼠末次给药后开始禁食，12 h后将大鼠断头处死，剖开腹部，将肝脏上的血液清洗干净后取出肝脏，在用生理盐水洗净，将水分用滤纸吸干，切割标本后，称取重量.加入一定量的PBS（pH=7.4），用匀浆器将标本匀浆充分.3 000 r/min离心30 min.取上清液，分装后放入-80℃冰箱保存备用［3-5］.

2.5双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA双抗体夹心法是将纯化的抗体结合到固相载体上形成固相抗体，其能和待检样品中的相应抗原结合形成免疫复合物，在彻底洗涤后加入酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，通过标准曲线计算样品，计算抗原的量.

1）标准品的制备：先取出酶标包被板，设置5个孔，在第一孔中加100μL的标准品和50μL的标准品稀释液，充分混匀，然后从第一孔取100μL加到第二孔，加标准品稀释液50μL，混匀；从第二个孔中取50μL弃掉，再取50μL加到第三个孔中，加标准品稀释液50μL，混匀；混匀后从第三个孔中取50μL加到第四个孔中，加标准品稀释液50μL，混匀后从第四孔中取50μL加到第五孔中，加标准品稀释液50μL，混匀后从第五孔中各取50 μL弃掉.CYP1A2稀释后各孔浓度分别为30、20、10、5pmol/L、2.5 pmol/L.CYP2E1稀释后各孔浓度分别为30、20、10、5、2.5 u/L.

2）加样：加样时应将所加物加在酶标包被板上板孔的底部，避免加在孔壁上面，不可溅出和产生气泡.设置空白孔，待测样品孔.在待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL，轻轻晃动混匀.

3）温育：用封板膜封板后置 恒温37℃温育30 min.

4）配液：浓缩洗涤液用蒸馏水稀释.

5）洗涤：除掉封板膜，倒掉液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后倒掉液体，实验重复5次，最后拍干.

6）加酶：处空白孔每孔加入50μL的酶标试剂.

7）温育：操作同3）.

8）洗涤：操作同5）.

9）显色：加入50μL的显色剂 A，然后加50 μL的显色剂B，轻轻震荡混匀，避光，37℃显色15 min.

10）终止：每孔加终止液50μL，终止反应.

11）测定：酶标仪使用前先预热仪器30 min. 450 nm波长测量各孔的吸光度.测定时间应在加终止液后15 min.

3　实验结果

3.1肉桂水煎液对大鼠肝脏指数的影响

肉桂水煎液对大鼠肝脏指数结果表明（见表1）连续给药15 d后，给药组的脏器指数发生较为明显的改变，表明长时间给予肉桂水煎液对大鼠肝脏指数改变不明显.

表1　各组大鼠的肝脏指数（±S，n=8）

表1　各组大鼠的肝脏指数（±S，n=8）

注：同空白对照组比较*P＜0.05

/%空白对照组组别　剂量/（g·kg-1）　肝脏指数3.13±0.30肉桂组　21.6　2.26±0.60 -*

3.2肉桂水煎液对大鼠肝微粒体细胞色素CYP1A2量的影响

3.2.1CYP1A2酶标准曲线的制定

以X轴（横坐标）表示CYP1A2的浓度，Y轴（纵坐标）表示吸光值绘制标准曲线.用Excel制作标准曲线.每个测定的样本做3个平行反应，结果见表2和图1.

表2　CYP1A2标准品的吸光值

图1　CYP1A2酶标准曲线

根据标准曲线的直线回归方程式，将样品的吸光值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品CYP1A2的实际浓度.

3.2.2肉桂水煎液对大鼠肝微粒体CYP1A2酶的测定结果

如表3所示，肉桂水煎液对大鼠肝微粒体CYP1A2酶实验结果显示肉桂可明显升高（P＜0. 05）CYP1A2酶的活性，表明实验大鼠肝脏细胞微粒体中CYP1A2酶的活性受到长期给予的肉桂水煎液影响，这种影响是否是产生药效或毒副作用的相关研究有待于进一步探讨.

表3　肉桂水煎液对大鼠的CYP1A2活性结果（±S，n=8）

表3　肉桂水煎液对大鼠的CYP1A2活性结果（±S，n=8）

注：同空白对照组比较*P＜0.05

组　别　剂量/（mg·kg-1）　CYP1A2活性/（pmol·L-1）对照组　—33.835±3.356肉桂组　21.6　40.256±2.351*

3.3肉桂水煎液对大鼠肝微粒体细胞色素CYP2E1量的影响

3.3.1CYP2E1酶标准曲线的制定

以CYP2E1的浓度为X轴（横坐标），吸光值为Y轴（纵坐标）绘制标准曲线.用Excel制作标准曲线.每个测定的样本做3个平行反应，结果见表4和图2.

表4　CYP2E1标准品的吸光值

图2　CYP2E1酶标准曲线

根据标准曲线的直线回归方程式，将样品的吸光值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品CYP2E1的实际浓度.

3.3.2肉桂水煎液对大鼠肝微粒体细胞色素CYP2E1的测定结果

如表5所示，肉桂水煎液对大鼠肝微粒体CYP2E1酶实验结果显示与对照组相比，肉桂组对（P＜0.05）CYP2E1酶的活性具有显著性差异，从数据来看肉桂可明显促进大鼠肝微粒体CYP2E1酶的活性.表明长期给予肉桂水煎液对大鼠肝脏细胞微粒体中CYP2E1酶产生较大影响，但这种影响是否对其产生药效或毒副作用的相关研究也有待于进一步探讨.

表5　各组大鼠的CYP2E1活性（±S，n=8）

表5　各组大鼠的CYP2E1活性（±S，n=8）

注：同空白对照组比较升高*P＜0.05

组　别　剂量/（mg·kg-1）　CYP1A2活性/（pmol·L-1）对照组　—38.510±2.152肉桂组　21.6　45.443±3.154*

4　讨论

近年大量研究和临床报道发现，药物相互作用是临床上产生严重不良反应甚至死亡的主要原因之一.当几种药物联合应用时，不同药物之间相互作用而使药效减弱或增强，甚至产生预想不到的不良反应或毒副作用.目前人们公认与药物代谢相关的CYP450酶系（主要包括CYP1、CYP2、CYP3三个家族），其中CYP1A2、CYP3A、CYP2E1酶亚家族主存在肝脏中，占体内CYP450酶总量的13%，其中5%-10%的常规药物包括中药成分主要经CYP1A2的代谢，因此很多药物的疗效或毒性与CYP1A2酶的活性有关，因此，考察中药对CYP450酶的影响对于阐明中药的作用机理和探讨其可能产生的毒副作用，具有重要的药理学和毒理学意义［6-7］.CYP2E1酶在体内负责很多化学物质的代谢，大部分代谢为前毒物和前致癌物.一些药物可诱导或抑制CYP2E1和CYP1A2的活性，当与这些药物合用时就会导致药物间的相互作用［8-9］.

随着科学技术和医疗事业的快速发展，在多数的研究中，特别是药物治疗学研究中，药物间的相互作用逐渐引起人们的重视，人们普遍认为，中药药性平和、安全，副作用少.然而，中药中成分极为复杂，在临床上由于中药和西药间的相互作用通常也会引起很多的不良反应.显然，中药与西药、中药和中药联合用药可能产生药物的相互作用，而各种成分主要通过肝脏代谢，药物成分在体内的代谢速度增强或减慢，使药物的作用减弱或增强.因此，药物的基础研究及临床上应给予足够的重视［10-12］，肉桂在中药和临床中被广泛应用，本实验以肉桂水煎液为研究对象，考察其对大鼠 CYP1A2和CYP2E1的作用，推测在联合用药中可能发生的药物的相互作用.结果表明肉桂水煎液对大鼠肝微粒体中CYP1A2和CYP2E1的活性有诱导作用，本实验为指导肉桂临床合理用药和减少毒副作用产生的可能性提供了必要的实验基础.

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［2］刘亚静，张仲.药肉桂的药理作用研究进展［J］.现代中西医结合杂志，2011，20（23）：2989-2990.

［3］林梅，奇锦峰，韩坚，等.三种茶饮料对小鼠肠道首过效应及肝脏Cyp3a、Cyp2e1的影响［J］.中国临床药理学与治疗学，2011，16（1）：5-11.

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［5］吴黎艳，陈芝芸，严茂祥，等.三七对酒精性肝病大鼠肝组织CYP2E1表达的影响［J］.中华中医药杂志，2011，26 （6）：1395-1398.

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Influence of cinnamon decoction on cytochrome P450 CYP1A2 and CYP2E1

MENG Yong-hai1，2，WANG Xin-wei1，2，SHILian-hong1，2，KANG Tian-ji1，CHEN Zhong-xin1，LIJi3，ZHAIChun-mei1，2
（1.Key Laboratory of Chinese Materia Medica，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China；2.Ministry of Education，Heilongjiang Key Laboratory of TCM Pharmacodynamic Material Base，Harbin 150040，China；3.School of Basic Medicine，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

To study the influence of Cinnamon decoction on the activity of the livermicrosomal cytochrome P450 CYP1A2 and CYP2E1.A preliminary research was studied with double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）for cytochrome P450 CYP1A2 and CYP2E1.Compared with the blank control group，cinnamon decoction could increase the content of CY1A2 and CYP2E1 of rats showing an induced effect on activities of CY1A2 and CYP2E1.The attention should be paid to drug interactions when cinnamon decoction was used together with medicinemetabolized by CY1A2 and CYP2E1 clinically.

cinnamon；antibody sandwich enzyme-linked immunosorbentmethod；CYP450；CYP1A2；CYP2E1

R285

A

1672-0946（2016）02-0161-04

2015-04-10.

黑龙江省青年科学基金项目（QC2012C064）；黑龙江省自然科学基金面上项目（H201473）；黑龙江省教育厅科研课题（12531622）；黑龙江中医药大学优秀青年教师支持计划项目（2012RCQ16）

孟永海（1978-），男，博士，研究方向：中药药效物质基础研究

翟春梅（1978-），女，博士，高级实验师，研究方向：中药新药及药效物质基础研究.