五味子多糖对人脑胶质瘤U87细胞活力的影响及其机制

温娜，金宏，齐玲，唐泽波

(吉林医药学院基础医学院，吉林吉林132013)



五味子多糖对人脑胶质瘤U87细胞活力的影响及其机制

温娜，金宏，齐玲，唐泽波

(吉林医药学院基础医学院，吉林吉林132013)

目的观察五味子多糖(CPSC)对人脑胶质瘤U87细胞活力的影响，并探讨其可能作用机制。方法取适量对数生长期人脑胶质瘤U87细胞，分为A、B、C组和对照组，A、B、C组分别加入终浓度为200、400、800 μg/mL的 CPSP培养，对照组加入等体积细胞培养液培养，分别于培养24、48、72 h时观察各组细胞活力；培养48 h时取各组培养液上清，检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)。结果培养24、48、72 h时，A组细胞存活率分别为1.17±0.04、1.09±0.05、1.39±0.05，B组分别为1.01±0.03、1.01±0.03、1.21±0.02，C组分别为0.90±0.02、0.76±0.02、0.98±0.03，对照组分别为1.28±0.03、1.16±0.03、1.45±0.01；培养72 h时，B组细胞存活率与对照组相比，P<0.05；培养24、48、72 h时，C组细胞存活率与对照组相比，P均<0.05。培养48 h时A、B、C组及对照组培养液上清Caspase-3蛋白的相对表达量分别为0.79±0.02、0.96±0.01、1.13±0.01、0.78±0.01，B、C组与对照组相比，P均<0.05。结论高浓度CPSC可抑制U87细胞的活力，其机制可能是与CPSC促进细胞Caspase-3表达有关。

五味子多糖；胶质瘤；脑胶质瘤；多形性胶质母细胞瘤；细胞活力；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

脑胶质瘤是最为常见的颅内恶性肿瘤，发病率和病死率均居成年患者颅内恶性肿瘤的首位[1]。细胞凋亡在胶质瘤的发生、发展中起重要作用，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)是常用的临床检测指标。脑胶质瘤U87是多形性胶质母细胞瘤，是恶性程度最高的星形细胞瘤。目前临床尚无有效治疗方法，手术切除和放、化疗是其主要治疗方法，但患者预后较差[2]。寻找高效低毒的抗肿瘤药物是目前的研究热点[3]。五味子为木兰科植物五味子的干燥成熟果实，五味子多糖(CPSC)和木脂素是其主要活性成分[4，5]。中医认为其具有敛肺止咳[6]、滋补涩精[7，8]、止泻止汗[9，10]之功效。本课题组前期研究发现，CPSC可明显抑制体外培养胶质瘤细胞的增殖[11]。2015年1～12月，我们观察了CPSC对U87细胞活力的影响，并探讨其可能作用机制，旨在为脑胶质瘤的治疗提供理论依据。

1　材料与方法

1.1细胞、材料及试剂U87细胞由吉林大学基础医学部提供。CPSC由北华大学医学实验中心馈赠；四甲基偶氮唑蓝(MTT，Sigma公司)；RPMI1640细胞培养基(Hyclone公司)；小牛血清和胰蛋白酶(Gibco公司)；二甲基亚砜(DMSO，Thermo公司)；Caspase-3抗体(中杉公司)。

1.2U87细胞分组及CPSP给药方法取适量对数生长期U87细胞悬于培养液中，按细胞浓度8×105/mL接种于96孔板，每孔100 μL。将细胞分为A、B、C组和对照组，每组5个复孔。A、B、C组分别加入终浓度为200、400、800 μg/mL CPSP，对照组加入等体积5%的RPMI1640培养液，置入37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，备用。

1.3各组细胞活力检测采用MTT法。分别取CPSP作用24、48、72 h时各组细胞，检测CPSC对U87细胞生长的作用，取对数生长期各组细胞去上清，加入20 μL MTT继续培养4 h,150 μL DMSO振荡20 min，使其结晶溶解，10 min后在酶联免疫检测仪测定各组490 nm波长处的吸光度(A490)值，用不加细胞的空白孔调零，计算细胞存活率。细胞存活率=(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)。以细胞存活率代表细胞的活力。

1.4各组培养液上清Caspase-3蛋白检测采用ELISA法。取CPSC作用48 h时各组细胞，按细胞浓度1×105/mL接种于24孔板中，每孔100 μL,每组5个复孔。取培养液上清包被96孔酶标板4 ℃过液，封闭后加入Caspase-3抗体(1∶500稀释)4 ℃过夜。次日二抗(1∶1 000稀释)室温下孵育2 h，DAB显色。采用自动酶标仪测定各组在492 nm处的吸光度A值，计算Caspase-3蛋白的相对表达量。

2　结果

2.1不同时间点各组细胞存活率比较不同时间点各组细胞存活率比较见表1。

表1　不同时间点各组细胞存活率比较±s)

注：与对照组比较,*P<0.05，#P<0.01。

2.2各组细胞培养液上清Caspase-3蛋白水平比较培养48 h时A、B、C组及对照组培养上清Caspase-3蛋白的相对表达量分别为0.79±0.02、0.96±0.01、1.13±0.01、0.78±0.01，B、C组与对照组相比，P均<0.05。

3　讨论

五味子是我国著名的滋补性传统中药[12]，其提取物中含有多种化学成分，包括多糖、木脂素、挥发油、脂肪油、有机酸、氨基酸、色素等[13]。其中CPSC药理作用较为广泛，具有保肝[14]、抗氧化[15]、抗变态[16]、增强免疫力[17]、降脂[18]、降糖[19]、镇痛[20]、抗肿瘤[6～10]等多方面的药理作用。一方面CPSC可通过促进凋亡、氧化应激、清除氧自由基等多种方式抑制肿瘤生长;另一方面其可以通过调节机体的免疫能力来增强抗肿瘤作用[4]。大量实验研究表明，CPSC的抗肿瘤作用多与其诱导细胞凋亡有关。许娜等[7]研究发现CPSC能诱导卵巢癌细胞的凋亡，作用机制与凋亡的线粒体途径有关。卢冠男等[8]研究表明，CPSC抑制lewis肺癌细胞的增殖的作用机制可能与调控Fas/FasL系统有关。韩斌等[9]研究表明，CPSC对乳腺癌MCF-7细胞株的生长抑制作用与诱发细胞凋亡有关。

脑胶质瘤也叫胶质细胞瘤、胶质瘤，是发生于神经外胚层的恶性肿瘤，所以也叫神经外胚层肿瘤或神经上皮肿瘤。大多数肿瘤起源于不同类型的神经胶质，但根据组织发生学来源及生物学特征类似，对发生于神经外胚层的各种复杂肿瘤，一般都称为脑胶质瘤。就病理发生学而言，脑胶质瘤是在内部遗传易感因素与外部环境致病因素相互作用所导致的。一方面，细胞的遗传物质(DNA)及表观遗传物质水平，发生了足以致癌的突变，以及突变的组合，这些突变使细胞进入周期性有丝分裂、逃避凋亡、躲避细胞的生长接触抑制、躲避免疫抑制等，使细胞获得与持续增长相适应的能量代谢异常、诱导肿瘤新生血管生长。另一方面，一些环境的致癌因素也可能与胶质瘤的发生相关。有研究表明，电磁辐射，可能与胶质瘤的发生相关。但是，目前并没有证据表明，彼此间存在必然的因果关系。虽然大部分的胶质母细胞瘤患者都曾存在巨噬细胞病毒感染史，并且在绝大部分的胶质母细胞瘤病理标本中都发现存在巨噬细胞病毒感染，但两者间是否存在因果关系，目前也尚不清楚。为了系统地了解胶质瘤的分子病因学，美国在 2008年启动了胶质瘤的分子基因图谱工程。通过对胶质瘤的DNA进行测序，发现平均每个胶质母细胞瘤，有高达5个分子突变。其中，NF基因是最常见发生突变的抑癌基因；EGFR是最常见的原癌基因。这些分子突变，驱动各种信号通道的表达并构成胶质瘤发生、发展的分子基础。

U87细胞是多形性胶质母细胞瘤，是恶性程度最高的星形细胞瘤。具有发病率高、复发率高和治愈率低的特点，预后相对较差，病死率较高。因此，有必要研究对胶质瘤治疗有效的药物。本研究结果发现，A、B组和对照组细胞活力间差异无统计学意义，但细胞的生长均呈下降趋势。CPSP作用24、48、72 h时，C组细胞存活率均低于对照组；说明CPSC可以明显抑制胶质瘤细胞的生长，猜测其可能作用机制为：①诱导肿瘤细胞凋亡；②抑制瘤细胞的生长；③使肿瘤细胞坏死。国内外研究学者发现，在诱导肿瘤凋亡传导的通路中，线粒体信号传导通路一直处于极其重要的地位。线粒体凋亡通路在细胞凋亡过程中处于中心地位。Caspases是凋亡信号转导的共同通路，许多调控细胞凋亡的因素都通过Caspases酶系起作用，一旦被激活，即引起下游一系列的级联反应，使细胞凋亡不可避免。因此，Caspase-3被称为“凋亡蛋白酶”，在凋亡过程中起着关键性作用。以往研究发现CPSC可明显抑制体外培养的胶质瘤细胞增殖，本研究结果发现B、C组Caspase-3蛋白的相对表达量均高于对照组，说明CPSC可以通过增加凋亡通路执行蛋白Caspase-3的表达，促进细胞凋亡。

综上所述，高浓度CPSC可抑制U87细胞的活性，可能与其促进Caspase-3表达有关。但其具体作用机制还有待深入研究。

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Effects of schisandra chinensis polysaccharide on cell activity of human brain glioma U87 cells

WEN Na,JIN Hong,QI Ling,TANG Zebo

(College of Basic Medical Sciences,Jinlin Medical University,Jilin 132013,China)

ObjectiveTo observe the effects of schisandra chinensis polysaccharides(CPSC)on the cell activity of human brain glioma U87 cells,and to explore its possible mechanism.MethodsThe human glioma U87 cells in the logarithmic growth phase were divided into groups A,B,C and control group.The cells in the groups A,B and C were added with the final concentrations of 200,400 and 800 μg/mL of CPSP to culture.The control group was treated with the equal volume of cell culture fluid.The cell viability was observed at 24,48 and 72 h after culture.At 48 h,the cysteine aspartic acid proteinase 3(Caspase-3)in the nutrient solution supernatant was detected.ResultsAt 24,48 and 72 h,the cell survival rates of group A were respectively 1.17±0.04,1.09±0.05 and 1.39±0.05.The cell survival rates of group B were respectively 1.01±0.03,1.01±0.03 and 1.21±0.02.The cell survival rates of group C were respectively 0.90±0.02,0.76±0.02 and 0.98±0.03.The cell survival rates of the control group were respectively 1.28±0.03,1.16±0.03 and 1.45±0.01.At 72 h,the cell survival rate of group B was statistically significant as compared with that of the control group(P<0.05).Significant difference was found in the survival rate between group C and control group at 24,48 and 72 h(P<0.05).The relative expression of Caspase-3 protein in cultural supernatant of groups A,B,C and control group was respectively 0.79±0.02,0.96±0.01,1.13±0.01 and 0.78±0.01,and significant difference was found between the groups B,C and the control group(all P<0.05).ConclusionHigh concentration of CPSC can inhibit the viability of U87 cells,and its mechanism may be that cpsc promote the Caspase-3 expression.

schisandra chinensis polysaccharides;glioma;brain glioma;glioblastoma multiforme;cell viability;cysteine aspartate protease 3

吉林省科技厅资助项目(20140414049GH)；吉林省教育厅资助项目(2012329，2014365)。

温娜(1981-)，女，硕士，高级实验师，主要研究方向为脑肿瘤的治疗药物。E-mail: 51176680qq@.com

简介：唐泽波(1979-)，男，硕士，高级实验师，主要研究方向为脑肿瘤的治疗药物。E-mail: tzbking122981@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.002

R593.25

A

1002-266X(2016)27-0005-03

2016-04-29)