航海条件下血液不同保存方法对红细胞表达黏附分子的影响

刘书逊，唐大海，贺嘉蕾，韩利华，刘曼娇，吴　江



·临床医学·

·论著·

航海条件下血液不同保存方法对红细胞表达黏附分子的影响

刘书逊，唐大海，贺嘉蕾，韩利华，刘曼娇，吴江

目的探讨航海过程中血袋摆放方式对红细胞表达黏附分子的影响。方法于出航训练当日，采集4位健康志愿者全血，按常规方式制备红细胞悬液，每份均分成4份，1份作为对照组保存在医院输血科冰箱，采用直立贴放方式，另3份作为实验组分别采用平铺码放、直立贴放、垂挂固定3种方式同置于舰载储血冰箱。训练结束后，立即检测送至实验室检测红细胞黏附分子CD58, CD44, CD47的表达。结果与陆地保存红细胞比较，航海条件下舰载冰箱直立贴放保存的全血中红细胞表达CD44和CD47的水平显著升高，平铺码放保存的红细胞表达CD58的水平显著降低。结论从表达黏附分子角度，航海条件下，红细胞适宜采用直立贴放方式保存于冰箱中。

船载运输；血液保存；红细胞；黏附分子

找到适合于舰船上保存血液的条件是航海医学面临的一个新课题。航海时受波涌影响，放置于舰载冰箱中的全血实际上处于一种缓慢的、规律的振动状态，因此存放方式对红细胞的影响可能会不同于陆地上血库中的红细胞。除了作为循环中唯一的供氧者，红细胞通过供氧保证各组织脏器的正常生理功能，还作为一类免疫细胞与机体中的其他免疫细胞、血管内皮细胞等相互作用[1-2]。已有的研究显示，红细胞通过表达多种黏附分子，与T细胞、单核/巨噬细胞、血管内皮细胞黏附并相互影响各自的功能[3-4]。笔者的另一项研究显示，舰载冰箱中采用平放方式对红细胞的渗透脆性和免疫黏附功能的影响较大，在本研究中笔者主要从红细胞表达黏附分子(CD44，CD47，CD58)的角度探讨不同舰载摆放方式对红细胞的影响。

1　材料与方法

1.1血液采集与保存根据《献血者健康检查要求》(GB 18467-2011)，于出海训练前1 d、采集4名健康志愿者全血各200 ml(分别编号为a～d)，ACD抗凝。按常规方法制备红细胞悬液各160 ml，密闭条件下平均分装置4份血袋中，依次编号1～4。制备日，按常规血液储存条件垂直贴放于输血科专用储血冰箱内，各组1号作为陆地冰箱储存对照组，其余于出发当日冷链转送至出海训练船只的专用冰箱中，各组2号采用垂直固定悬挂方式、3号采用直立贴合方式、4号采用平铺码放方式。任务结束当日，同样冷链转送至输血科实验室送检。

1.2仪器与试剂FACS LSRII流式细胞仪购自美国BD公司。荧光素偶联的鼠抗人CD44-PE、CD47-PE、CD58-FITC单克隆抗体和同型对照抗体购自美国B.D. Pharmingen公司。

1.3航海条件2012年6月5-25日，任务船只随“神舟九号”海上应急救援保障编队出航。航行21 d，航程5 000 n mile。期间，船只摇摆5度14 d，8度、9度各2 d，10度3 d，总计摇摆度5～10度，中位5度。海区浪高1.5 m 7 d，2 m 1 d，2～2.5 m 1 d，2.5 m 6 d，2.5～3 m 2 d，3 m及以上4 d，总计浪高在1.5～3 m，中位2.5 m。海况4～5级，其中5级5 d，4级16 d，中位4级。

1.4流式细胞术(fluorescence activating cell sorter,FACS)各组细胞先用预冷PBS配制1×106/ml的红细胞悬液，分别加入终浓度为1 μg/ml荧光素偶联的抗黏附分子抗体(CD58, CD44, CD47)或同型对照抗体(购自B.D.Pharmingen)，混匀后4℃放置15 min，再用PBS洗涤3次，重悬于300 μl PBS中，上机检测(机型：B.D.FACS LSRII)，FACSDiva软件分析。黏附分子的表达以相对荧光强度表示，计算公式为：抗黏附分子抗体标记的几何平均荧光强度(geometric fluorescence intensity,GMI)/同型对照抗体标记样品的GMI。

1.5统计学处理以相对荧光强度和每组均数±标准差(x±s)表示，采用配对样本t检验，以GraphPad Prism软件分析作图，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1船载冰箱3种存放方式保存红细胞表达CD44的水平与留存输血科冰箱中的红细胞比较，船载冰箱采用直立贴合放置方式(G2)保存的红细胞表达CD44(P=0.036)明显上调；采用垂直悬挂(G1)和平铺码放方式(G3)保存的红细胞膜表面CD44的表达没有发生显著改变。见图1。

注：A为各组中代表性CD44的表达(点图)；B为各组所有样本CD44表达的相对荧光强度，红色显示平均值±标准误；G1～3为3种存放方式；aP<0.05图1　不同船载冰箱存放方式对红细胞表达CD44水平的影响

2.2船载冰箱3种存放方式保存红细胞表达CD47的水平与留存输血科冰箱中的红细胞比较，船载冰箱采用直立贴合放置方式(G2)保存的红细胞表达CD47(P=0.001)明显上调；采用垂直悬挂(G1)和平铺码放方式(G3)保存的红细胞膜表面CD47的表达没有发生显著改变。见图2。

注：A为各组中代表性CD47的表达(点图)；B为各组所有样本CD47表达的相对荧光强度，红色显示平均值±标准误；G1～3为3种存放方式；aP<0.01图2　不同船载冰箱存放方式对红细胞表达CD47水平的影响

2.3船载冰箱3种存放方式保存红细胞表达CD58的水平与留存输血科冰箱中的红细胞比较，船载冰箱采用平铺码放方式(G3)直立贴合放置方式(G2)保存的红细胞表达CD58(P=0.001)发生明显下调；采用垂直悬挂(G1)和直立贴合放置方式(G2)保存的红细胞膜表面CD58的表达没有发生显著改变。见图3。

注：A为各组中代表性CD58的表达(点图)；B为各组所有样本CD58表达的相对荧光强度，红色显示平均值±标准误；G1～3为3种存放方式；aP<0.01图3　不同船载冰箱存放方式对红细胞表达CD58水平的影响

3　讨论

红细胞膜表面黏附分子，如CD44，CD47和CD58等的表达水平在一定程度上反映其衰老程度。有研究表明，储存红细胞表达的CD44分子，在28 d后，与年轻红细胞相比会发生显著性的下调[5]。在不含有白细胞的储存血中，红细胞表面的CD47和CD58在保存期不会发生明显的改变，而在含有白细胞的储存血液中，CD47和CD58的表达会迅速降低[5]。因此，通过储存红细胞表面黏附分子的表达可以判断红细胞的衰老情况，从而为研究储存血液的方式提供一种检测手段。

衰老红细胞更容易被脾脏中的单核巨噬细胞吞噬清除，红细胞膜表面的CD47分子的表达水平调控着红细胞对巨噬细胞吞噬的反应性。CD47能够结合巨噬细胞表面的信号调控蛋白α(SIRPα)，SIRPα是一种负向调控分子，其所转导的信号抑制巨噬细胞的吞噬功能[6]。因此，低表达CD47的衰老红细胞，因不能够结合更多的SIRPα分子而使负向调控信号的强度较弱而更容易被巨噬细胞吞噬。舰载冰箱直立贴放方式保存的红细胞在CD47分子的表达上明显的高于陆地保存的红细胞和其他两种保存方式保存的红细胞，说明这种方式更能够延缓红细胞的衰老。

CD44作为一种膜糖蛋白，表达广泛，主要参与细胞-细胞相互作用，细胞黏附以及迁移等过程。CD44已知的大多数配体为细胞外基质，包括透明质酸、骨桥蛋白、胶原配体，此外还有基质金属蛋白酶。有研究发现，红细胞膜表面CD44能够与中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞的未知配体相互作用，进一步激活中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞与内皮的黏附[7]。这种效应提示，在炎症或者其他病理条件

下，红细胞通过与这些细胞的相互作用促进有可能促进这些炎性细胞迁出血管外或者形成血栓。衰老红细胞和长期保存的红细胞的CD44表达下调，表明保存红细胞在体内的这种生理功能降低。因此，舰载冰箱直立贴放方式保存的红细胞在CD44分子的表达上明显的高于陆地保存的红细胞和其他两种保存方式保存的红细胞，说明这种方式更能够延缓红细胞的衰老或者更接近生理条件下的红细胞。

此外，船在冰箱中平铺码放保存的红细胞CD58的表达显著低于陆地保存红细胞和其他两种方式，说明这种方式不适合在航行过程中保存红细胞。另一份通过检测红细胞渗透脆性和黏附功能的研究，也证实了这种方式的缺陷。鉴于垂直悬挂固定方式保存的红细胞表达CD47的水平低于直立贴放方式，因此舰载冰箱直立方式更适于航海时的输血贮存需要。

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(本文编辑：甘辉亮)

The expression of adherent molecules in the preservation of human red blood cells during deployment at sea

LiuShuxun,TangDahai,HeJialei,HanLihua,LiuManjiao,WuJiang

(DepartmentofImmunology&NationalKeyLaboratoryofMedicalImmunology,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

ObjectiveTo investigate the effect of blood-bag placement mode in the refrigerator on the expression of adherent molecules in the preservation of human erythrocytes onboard the ship.Methods On the first day of deployment to sea, 4 blood samples were collected from 4 healthy volunteers. Erythrocyte suspension was equally aliquoted into four portions, one as the control group was placed vertically in the refrigerator of the hospital and the other three as the experiment group were preserved in the same refrigerator onboard the ship in 3 different placement modes (the layer-upon-layer mode, the upright mode and the vertical suspension mode). After completion of the training, the preserved samples were immediately sent to the laboratory for the detection of the expressions of CD47, CD58, and CD44.ResultsThe expression levels of CD44 and CD47 in the erythrocytes of whole blood placed on the shipboard refrigerator were significantly higher, as compared with those of the control group in the hospital. The expression levels of CD58 in the erythrocytes placed in the layer-upon-layer mode decreased significantly.ConclusionFrom the aspect of the expression of erythrocyte, the upright placement mode was most suitable for the preservation of blood in the shipboard refrigerator.

Shipboard blood transport; Blood preservation; Erythrocyte; Adherent molecule

国家自然科学基金(81172787，31470858)

单位]200433上海，第二军医大学免疫学教研室(刘书逊)；解放军第四一一医院检验科(唐大海、贺嘉蕾、韩利华、刘曼娇)；上海交通大学医学院附属仁济医院输血科(吴江)

吴江，电子信箱：wujiang@renji.com

R82

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2016.04.016

2015-12-20)