益气活血方对大鼠慢性脊髓压迫后受损脊髓组织形态学及其PGE2、PLA2含量的影响

2016-08-31宇夏建龙刚杨挺蔡南京中医药大学江苏南京003江苏省中医院江苏南京0046

中国中医急症 2016年6期

杨　宇夏建龙△　陈　刚杨　挺蔡　平（.南京中医药大学，江苏南京 003；.江苏省中医院，江苏南京 0046）

杨宇1夏建龙1△陈刚2杨挺1蔡平2
（1.南京中医药大学，江苏南京 210023；2.江苏省中医院，江苏南京 210046）

目的观察不同浓度的益气活血方对大鼠慢性脊髓压迫后受损脊髓组织的形态学及其前列腺素E2（PGE2）、磷脂酶A2（PLA2）含量的影响。方法 60只SD大鼠，随机选取10只作为假手术组，仅暴露椎板，未造成脊髓压迫，以0.9%氯化钠注射液进行灌胃；其余的SD大鼠采用自体第7颈椎棘突椎间移植法制造大鼠脊髓压迫模型，术后1 d根据脊髓功能的评分将其分为，A组造模后，以不同浓度的益气活血方进行灌胃；B组造模后，以颈复康进行灌胃；C组造模后，以0.9%氯化钠注射液进行灌胃。灌胃结束，处死动物并取其受损脊髓组织做以下处理：1）经HE染色后观察受损脊髓组织的形态学改变；2）采用ELISA方法测其PGE2、PLA2的含量。运用统计学手段对实验结果进行分析，基于上述结果综合评估益气活血方和颈复康对炎性介质的抑制功效。结果受损脊髓组织形态学的观察结果显示；中药高、中、低浓度组以及颈复康组的受损脊髓组织内均可见胶质瘢痕和空洞形成，且空洞总面积均明显小于NS组。通过检测大鼠受损脊髓组织中的炎症因子发现，中药中浓度、中药高浓度及颈复康均能显著降低受损脊髓组织内PGE2的含量（P<0.05），各浓度的益气活血方及颈复康均能显著减低受损脊髓组织内PLA2的含量（P<0.05）。结论在大鼠慢性脊髓压迫模型中，益气活血方能有效抑制受损脊髓组织的炎症反应，并促进其脊髓功能的恢复。

益气活血方大鼠脊髓型颈椎病前列腺素磷脂酶A2HE染色

【Abstract】Objective：To evaluate the potential effects of different concentrations of PNQAB（the prescription for nourishing qi and activating blood）on morphological changes and contents of PGE2，PLA2in the damaged rats′spinal cord tissue.Methods：Ten SD-Rats were randomly chosen as the sham-operated group from the sixty subjects，fed with the normal saline within explosion of the vertebral lamina and free from oppression of the spinal cord；the remaining were applied to establish rat′s spinal oppression model by grafting the self-7th cervical vertebrae spinous process at the part of C4～5 or C5～6 intervertebral space，then divided into three groups based on the assessment results of the spinal cord function at the 1st day postoperatively，fed with the PNQAB under different concentrations（Group A），Jinfukang（Group B）and Normal saline（Group C），respectively.All the animals were sacrificed by the end of the gastric perfusion and the damaged tissue of spinal cord was removed for the examination of morphological changes（after HE staining）and the determination of contents of PGE2and PLA2（tested with ELISA method）of the specific tissue in rats′spinal cord.Results：The results of HE staining showed that glial scars and cavitation were sporadically formatted in Group A and Group B，but existed widely in Group C，and the total areas of cavitation in Group A and Group B were obviously less than Group C.Furthermore，groups fed with the PNQAB under high/medium concentration and Jinfukang could notably decreased the content of PGE2（P< 0.05），while all the groups fed with the PNQAB and Jinfukang had a positive effects on the inhibition of PLA2production in the tissues of the rats′damaged spinal cord significantly（P<0.05），compared with those fed with normal saline.Conclusions：The PNQAB effectively inhibits inflammatory response in tissues during rat′s recovery of chronic spinal oppression model，and promotes the recovery of spinal cord function.It is an effective treat-ment method，worthy of further promotion.

【Key words】PNQAB；Rat；Cervical spondylotic myelopathy；PGE2；PLA2；HE staining

脊髓型颈椎病（CSM）是由于颈椎间盘退变及突出、椎体后缘及钩椎关节骨质增生、后纵韧带骨化、黄韧带肥厚或钙化，导致脊髓受压、缺血，继而出现脊髓功能障碍的疾病，临床症状主要表现为颈项部疼痛、上肢酸胀、疼痛、麻木、无力感，严重者可出现上肢肌力下降，握拳困难，手指精细动作减弱，行走不稳、易摔跤以及肢体的触痛觉减退或过敏，胸腹部的束带感。本病好发于中老年人；发病率一般为人群的10%～15%；男性多发，本病常因天气变化；寒冷刺激；劳累等原因诱发。益气活血方在圣愈汤的基础上加减而成；原方出自《脉因证治·金疮》卷四；为著名医家朱震亨所创。导师在临床中；以该方为基本方，随症加减，灵活运用，用于治疗CS以及改善CS术后的脊髓功能状态；对治疗该病具有很好的疗效；且服用安全、方便。笔者采用大鼠自体第7颈椎棘突椎间移植法制造大鼠脊髓压迫模型，来观察益气活血方对大鼠慢性脊髓压迫后受损脊髓组织的形态学及其前列腺素E2（PGE2）、磷脂酶A2（PLA2）含量的影响，以期为益气活血方的临床应用提供科学依据。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物SD大鼠，雌雄各半，60只，体质量（200±2）g，由南京中医药大学实验动物中心提供，SPF级，许可证号：SCXK（京）2012-0001。

1.2试剂与仪器黄芪、陈皮、甘草、桂枝、羌活、丹参、茯苓、当归、蜈蚣、延胡索、地龙、独活、泽兰、葛根、0.9%氯化钠注射液、酒精、碘伏、青霉素、均购置于江苏省中医院，颈复康（益丰大药房，批号490283），纯水、多聚甲醛由南京中医药大学唐仲英实验室提供，10%水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：20140115），PGE2、PLA2试剂盒购置于南京建成生物研究所并由其研究所代测，HE染色由南京市妇幼保健院代测。刀柄、眼科剪、线剪、有齿镊、无齿镊、持针器、弯钳、直钳、万分之一天平、剃毛机等均由南京中医药大学药理研究室提供，1 mL注射器、针、线、23号刀片、医用纱布、棉球均购置于江苏省中医院。

1.3样品制备分别取中药材于江苏省中医院代煎，将煎好的中药按成人临床用药量的20倍换算为高浓度、10倍换算为中浓度、5倍换算为低浓度，在南京中医药大学药理实验室浓缩，中药高浓度浓缩至5.4 g/mL（生药）、中药中浓度将高浓度用纯水等倍稀释至2.7 g/mL（生药）、中药低浓度将中浓度用纯水等倍稀释至1.35 g/mL（生药）；用研钵将颈复康磨细之后，用纯水配制成0.17 g/mL；用万分之一天平称取10 g水合氯醛，用100 mL纯水配制成10%水合氯醛备用。

1.4大鼠脊髓压迫模型参考文献［1］。随机选取10只，为假手术组（只暴露颈椎椎板，不咬除椎板，不造成大鼠脊髓压迫模型），其余50只均在10%水合氯醛（0.4 mL/kg）麻醉下，用剃毛机剃除大鼠颈后部的毛，常规碘伏消毒，铺巾，取大鼠颈椎后正中切口长3～4 cm，切开皮肤、皮下，暴露颈肩部肌群，找到第七颈椎棘突（所有颈椎棘突均可用手触及，最高突起处即是），自下往上正中切开肌肉群向两侧牵开，沿棘突两侧以23号刀片剥离棘突上附着肌肉，即可暴露整个颈椎骨面；自第7颈椎棘突基底部离断第7颈椎棘突并取出，刮除骨面附着组织备用；自第7颈椎棘突往上找到第5或6颈椎椎板，咬除部分椎板，并取相应直径的第7颈椎棘突骨块植入椎间隙，以不出现松动为度，并尽量向椎管内嵌压，以出现上肢肌肉反射性抽搐为度，缝合肌肉、皮肤，肌肉注射青霉素8万U/只，术毕。青霉素连续肌肉注射3 d，术前及术后均不必禁食。为了避免老鼠相互挤压造成的伤害甚至死亡，术后采取单笼喂养并任其自由活动，造模过程中由于麻醉剂量控制不精准导致术中大鼠死亡7只，3只可能是因为手术创伤太大从而导致全身衰竭而亡。

1.5分组及给药为了使大鼠脊髓的急性压迫转为慢性压迫，术后适应性观察2周，待大鼠伤口基本愈合后采取合笼喂养，为保证脊髓损伤轻与重的大鼠在每组中的数量相当，术后1 d根据改进Rivaling的斜板实验的平均度数、Tarlov评分、Basso Beattie Bresnahan （BBB）评分将其分为益气活血方高浓度组［（54 g/（kg·d）］、益气活血方中浓度组［27 g/（kg·d）］、益气活血方低浓度组［13.5 g/（kg·d）］组、颈复康组（1.7 g/kg）、NS组，益气活血方高、中、低浓度组以及颈复康组采用1 mL/ 100 g灌胃给药，NS组及假手术组灌服等量（1 mL/ 100 g）0.9%氯化钠注射液，每日给药1次，连续4周。

1.6取材取材后以压迫点为中心分成两部分，一部分放于4%多聚甲醛中保存用于HE染色，另一部分放进液氮中冻存，后转入-70℃冰箱中保存，用时取出用于检测PLA2、PGE2的含量。

1.7统计学处理采用SPSS22.0统计软件处理。计量资料以（±s）表示，进行单因素方差分析（ANOVA）和两两比较的LSD和Tamhane'T2（M）检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1各组大鼠脊髓组织中PGE2、PLA2的含量见表1。中药中浓度、中药高浓度及颈复康均能显著降低受损脊髓组织内PGE2的含量，与NS组差异有统计学意义（P<0.05），中药低浓度亦能显著降低其PGE2的含量，与NS组差异无统计学意义（P>0.05）；各浓度的益气活血方及颈复康均能显著减低受损脊髓组织内PLA2的含量，与NS组比较有显著差异（P<0.05），抑制受损脊髓组织内PGE2、PLA2的含量效果强弱顺序为：中药高浓度>颈复康>中药中浓度>中药低浓度，表明益气活血方具有通过抑制受损脊髓组织内炎性介质的产生来抑制炎症反应，消除脊髓神经细胞的水肿的作用，从而改善脊髓周围组织的痛觉过敏状态，缓解疼痛，达到治疗脊髓型颈椎病的效果。

表1　各组大鼠脊髓组织中PGE2、PLA2含量比较（±s）

与NS组比较，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

组别　n　PGE2含量（ng/L）PLA2含量（ng/mL）中药低浓度组　8　196.258±8.388　33.757±1.234*中药中浓度组　9　194.084±16.028*　33.209±0.872**中药高浓度组　9　186.553±8.514**　31.676±0.678***颈复康组　9　191.182±17.451*　32.773±1.207***NS组　8　207.298±9.106　35.247±1.465假手术组　7　170.851±13.627***　30.528±1.716***

2.2各组大鼠脊髓组织常规病理染色结果见图1和图2。假手术组中神经细胞内细胞形态完好，细胞核染色为蓝黑色，细胞核完整，脊髓组织结构正常，无空泡样改变；NS组可见大量的神经细胞核固缩，细胞肿胀、坏死，脊髓组织内可见大量的瘢痕组织及大空泡样改变；中药高浓度组可见少量的脊髓组织空洞及瘢痕组织，散在细胞核固缩，空洞周围存在大量的神经元样细胞，细胞核分布逐渐集中分布；中药中浓度组可见脊髓组织空洞较小，少量瘢痕组织及固缩的细胞核，神经细胞形态趋于正常，胞浆也逐渐增多；中药低浓度组可见脊髓组织呈大量的小空泡样改变及固缩的细胞核呈游离状态分布，存在形态正常的神经元样细胞；颈复康组可见较多的空泡样改变及少量瘢痕组织，细胞核固缩，细胞坏死，周围存在正常形态的神经元样细胞，实验结果表明了，益气活血方具有促进受损脊髓组织内神经细胞的修复作用。

图1　各组大鼠脊髓组织常规病理染色结果（HE染色，×400）

3　讨　论

脊髓型颈椎病在临床上主要以实证、虚证及虚实夹杂证常见，实证以痹证居多；常表现为肢体的疼痛麻木、酸胀，无力感，其病在脾；由瘀血、痰湿等所致。虚证以痿证为多；表现为肌肉萎软无力、行走不稳，其病在脾、肾；属气虚、肾亏所致。本病为本虚标实，气血不足，瘀血内阻，髓失所养之证。劳则耗气，久劳其气必虚；“气为血之帅”“气行则血行”，气虚导致血瘀，血瘀导致不通则痛；气能生血，气虚则血亦虚，肌肤、筋骨、脊髓失于濡养则可出现肢体麻木、肌肉萎软无力、行走不稳等症状；脾失健运；水湿不化；湿着于内则卫气不荣；肌肉顽痹；此外；气血失和；筋脉失养；腠理空虚；风寒湿邪乘虚而入；合而为痹。根据中医学理论“气行则血行，治血先治气”的观点，笔者以圣愈汤的为主方加减组成“益气活血方”，其组成为黄芪、陈皮、甘草、桂枝、羌活、丹参、茯苓、当归、蜈蚣、延胡索、地龙、独活、泽兰、葛根等14味中药，方中重用黄芪、当归、丹参为君药，取其补益气血、活血化瘀之功，延胡索、地龙、蜈蚣、桂枝活血化瘀通络，羌活、独活祛风胜湿止痛，陈皮、茯苓、泽兰燥湿利水，葛根生津舒筋，甘草调和诸药，诸药共奏益气活血、利水消肿、通络止痛之功。

脊髓型颈椎病属中医学中的“痹”“痿”等证范畴。《济生方·痹》亦云“皆因体虚；腠理空疏；受风寒湿气而成痹也”。研究表明脊髓组织受压迫、损伤能引起炎症反应；PLA2可促进前列腺素、白三烯、血栓素、血小板活化因子等重要炎性介质的分泌［2］，PGE2作为一种炎性标志物［3］，除了引起血管扩张外，还能增强局部血管通透性，刺激脊髓局部产生水肿。脊髓、神经根周围的炎症是引起颈项部疼痛的主要原因，且PGE2在炎症过程中扮演着重要角色［4］。药理实验显示黄芪提取物具有明显的抗炎作用［5］；其抗炎机制与黄芪甲苷能抑制NF-κB途径有关［6］。《景岳全书·本草正》云“当归，功专补血，又能行血，补中有动，行中有补，诚血中之气药，亦血中之圣药也”。当归在保护损伤神经及促进神经再生方面具有重要作用［7］，同时，当归通过抑制血小板凝聚等作用来达到“活血”的效果，并通过抑制PGE2产量、COX-2活性以及COX-2 mRNA和蛋白的表达来达到抗炎的作用［8］。丹参可明显降低中性粒细胞的趋化性，抑制溶酶的释放，降低血中的PGE2和PGF2α的水平，这是丹参抗炎的主要机制［9］。黄芪、丹参、当归等能直接扩张周围血管，明显改善微循环；对渗出的炎性介质有明显的抑制作用［10］；能减轻神经水肿、炎症、出血、变性和脱髓鞘，来促进神经的再生［11］；方中诸药合用，有明显的抗炎以及改善脊髓型颈椎病术后的脊髓功能状态的作用。脊髓损伤后组织内的血流量改变是导致脊髓神经功能丧失的重要因素［12］。丹参促进受损脊髓的修复作用与类抗血小板聚集以及对抗缩血物质的作用有关［13］。

该研究可以证明，益气活血方具有抑制炎症反应，改善受损脊髓周围组织的痛觉过敏状态，抑制受损脊髓组织瘢痕化以及空泡的形成，促进受损神经细胞的修复，缓解神经细胞的变性、坏死的作用，相关临床研究表明圣愈汤［12］、益气活血方［13］对改善脊髓型颈椎病术后的脊髓功能状态有显著的疗效，其机制还有待于进一步的深入研究。

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