兴安落叶松的胚性愈伤组织诱导与体胚发生研究

田新华，姜天瑞，翁海龙*

(1.黑龙江省林业科学研究所，哈尔滨150081；2.黑龙江省科技成果转化中心，哈尔滨150028)



兴安落叶松的胚性愈伤组织诱导与体胚发生研究

田新华1，姜天瑞2，翁海龙1*

(1.黑龙江省林业科学研究所，哈尔滨150081；2.黑龙江省科技成果转化中心，哈尔滨150028)

对兴安落叶松合子胚诱导胚性愈伤组织及体细胞发生进行研究，旨在解决落叶松无性系快速繁殖问题，对于遗传改良以及人工种子生产有重要意义。研究结果表明：1/4 LP(改良)培养基最适宜诱导胚性愈伤组织，同时添加激素6-BA 5×10-6M、NAA 5×10-8M的培养基中体胚诱导率较高，诱导效果较好。

落叶松；离体培养；体胚发生

落叶松(Larixgemelinii)原产于北半球的北温带地区和喜玛拉雅山脉，该属约有18个种，分布范围较广，东北地区最多[1]。据统计，落叶松林木的蓄积量在东北地区占针叶林总蓄积量的39.4%；占黑龙江省用材林蓄积量的23.6%，其中大兴安岭林区占用材林总蓄积量的67%[2]，是我国东北地区的主要造林树种。落叶松比松树和云杉生长快，以早期速生、抗逆性强著称，且落叶松木材重而坚实，抗压及抗弯曲的强度大，而且耐腐朽，木材工艺价值较高。落叶松木纤维长，纤维的长宽比大，管胞壁厚，生产的纸张具有较高的强度、拉力，耐破指数高。所以大量用于建筑业、装演业、造纸业[3-5]。但是落叶松生长周期较长，有性繁殖后代变异较大；落叶松扦插繁殖生根率很低[6]；在高寒地区的限制因素很多，所以对一些优良性状难以维持，大规模繁殖利用难度较大。严重地影响了落叶松遗传改良的进程，限制了落叶松良种使用比率和发展速度。本研究旨在利用组织培养的方法更快更好地诱导出兴安落叶松的胚性愈伤组织或体胚，在短期内可以获得大量遗传上和形态上均一的苗木[6]，为遗传改良以及人工种子生产等方面奠定坚实的基础。

1　材料与方法

1.1试验材料

本试验供试材料来源于林口青山落叶松国家良种基地兴安落叶松的成熟种子，分别于6月、9月、12月不同时间进行分批试验。

1.2试验方法

1.2.1种子的清洗与消毒。将种子用蒸馏水浸洗20min，分别采用70%酒精和0.1%HgCl2与70%酒精和3%NaClO进行灭菌处理，然后在超净工作台下用无菌水反复漂洗6次，每次漂洗2 min，取出种子用滤纸吸干多余水分，备用。

1.2.2基本培养基筛选试验。采用眼科剪子与解剖刀剥取成熟种子的合子胚为外植体，分别接种于MSG、DCR、1/4LP(改良)培养基中。培养基中添加蔗糖30g/L，日产琼脂粉6g/L，pH值调至5.8。每皿培养2个外植体，每个处理5皿，每个处理重复3次。

1.3外植体的诱导与分化培养

诱导培养：将接种后的培养基置于黑暗无光条件进行暗培养，温度控制在23±2℃。培养基中添加蔗糖30g/L，日产琼脂粉6g/L，pH值调至5.8。

分化培养：将胚性愈伤组织、早期体胚接种于分化培养基培养，温度控制在23±2℃。培养基中添加蔗糖30g/L，日产琼脂粉6g/L，pH值调至5.8。

将外植体放于直径为5cm的塑料皿内，皿中含有培养基5mL。用封口膜封口，再用铝箔把皿包裹，放于20℃暗培室中恒温培养，30d继代1次。

1.4数据处理与统计分析

通过统计愈伤组织、体细胞胚的出现数，分别计算出愈伤组织、体细胞胚产生的百分数。

体胚发生率=产生体胚的幼胚的数量/接种培养的所有胚的数量×100%。

胚性愈伤诱导率=产生愈伤的幼胚的数量/接种培养的所有胚的数量×100%。

试验获得的愈伤组织用解剖镜记录、拍照。培养30d统计胚性愈伤组织诱导率，采用Excel 2003和dps7.05数据统计软件对实验数据进行分析和多重比较[7]。

2　结果与分析

2.1不同灭菌方法对胚性愈伤组织诱导的影响

外植体的消毒处理是植物组织培养中的重要环节，具体的消毒方案因植物材料和取材时期而异。对兴安落叶松种子进行消毒处理，培养10d统计外植体的污染率，结果如表1所示，不同处理对外植体污染率和启动率的影响不同。HgCl2的消毒处理导致的污染率最高，为70.0%，比NaClO消毒处理12min的污染率高2倍多；而NaClO消毒时间长短的差别不是很明显，以消毒处理12min表现最好，为26.7%，因此以NaClO 消毒处理12min为兴安落叶松种子表面灭菌的最佳方法。

表1　不同处理方法对兴安落叶松种子灭菌效果的影响

2.2基本培养基对兴安落叶松体胚发生启动的影响

对6月份处理的种子进行消毒处理接种于不同培养基上培养，经过30d培养观察发现(如表2所示)，合子胚在本试验所采用不同基本培养基上均能产生愈伤组织，但是愈伤组织的诱导率差异显著。这说明，基本培养基的种类对胚性愈伤组织诱导率影响较大，其中培养基MSG和DCR对胚性愈伤组织的诱导率较低且差异不显著，而与1/4LP(改良)培养基对胚性愈伤组织的诱导率相比差异显著(P<0.05)。兴安落叶松胚性愈伤组织诱导率以1/4LP(改良)培养基最高，并且培养基中的外植体产生白色、透明丝状胚性愈伤组织。

表2　不同培养基上的兴安落叶松

注：不相同字母表示有显著差异(P<0.05)，下同。

2.3激素组合对兴安落叶松体胚发生启动的影响

表3　不同激素组合对兴安落叶松胚性愈伤组织诱导的影响

我们将不同时期所取的外植体按照下列组合进行诱导试验。试验结果表明，生长素与细胞分裂素的浓度配比对外植体脱分化形成愈伤组织起着关键的控制作用。如表3所示，随着激素2,4-D浓度的提高，愈伤组织诱导率也随之提高，形成有粘性且松散的愈伤组织，这说明适当的提高2,4-D的浓度有必要的。6-BA、KT浓度增加时，也可促进愈伤组织增长，但是继代之后发现胚性愈伤组织的胚性开始丧失，这说明继代适当地更换培养基来保证胚性愈伤组织的保持与增殖是有必要的。

2.4兴安落叶松胚性愈伤组织继代培养及体胚发生的影响因素

选用1/4 LP(改良)培养基为基本培养基，分别附加不同浓度6-BA 、NAA进行胚性愈伤组织的继代培养。

将离体胚平放于直径为5cm的塑料皿内，皿中含有培养基5mL。用封口膜封口，再用铝箔把皿包裹，放于20℃暗培室中恒温培养，30d继代1次。

继代过程中发现有部分白色或浅黄色愈伤组织逐渐褐化，松散状也转换成致密不透明，失去分化能力。随着激素浓度的调整有部分未褐化的胚性愈伤组织逐渐诱导体胚发生，其中以浓度为6-BA 5×10-6M和NAA 5×10-8M诱导效果最好，即1/4 LP(改良)+6-BA5×10-6M+NAA 5×10-8M培养基中体胚诱导率较高，诱导效果较好。

3　小结

3.1在落叶松体胚发生过程中，细胞分裂素和生长素的配比对外植体脱分化形成胚性愈伤组织起着重要的调控作用。因此必须通过调整各激素浓度之间配比才更有利于体胚发生。

3.2本试验以成熟合子胚的外植体诱导胚发生，尽管在继代过程中褐化、死亡，但以成熟合子胚的外植体诱导落叶松体胚的发生还是可行的，今后还要继续探索各激素的合理配比进一步提高体胚发生的诱导率。

附图　球形胚

[1]王企明.松树[M].南京:江苏科学技术出版社，1994.

[2]贾治邦.中国森林资源报告：第七次全是森林资源清查[M].北京：中国林业出版社，2009.

[3]周崟.中国落叶松属木材[M].北京：中国林业出版社，2001:171-179.

[4]李坚.木材科学[M]. 北京：高等教育出版社,2003:257-259.

[5]李坚.中国主要树种木材物理力学性质[M].哈尔滨:东北林业大学出版社,2006:147-154.

[6]王彦清，吴克贤，张泉.胡桃揪体细胞胚胎发生的研究[J].林业科技，2000,25(2):8-9.

[7]唐启义,冯明光.实用统计分析及其DPS数据处理系统[M].北京:科学出版社,2002.

Induction of Embryogenic Callus and Somatic Embryogenesis in Larix gemelinii

Tian Xinhua1，Jiang Tianrui2，Weng Hailong1*

(1.Heilongjiang Institute of Forestry Sciences,Harbin,Heilongjiang 150081;2. The center of Scientific and Technological Achievements of Heilongjiang Province,Harbin,150028)

this study zygote embryo ofLarixgemeliniiinduction of embryonic callus and somatic cells, aims to solve the problem of larch clones reproduce rapidly, has important significance for genetic improvement and artificial seed production. The results showed that the 1/4 LP (improved) medium for embryonic callus induction was suitabled, while adding hormone 6-BA 5 × 10-6m, NAA, 5 × 10-8m medium term embryo rate was higher, the induced effect was better.

Larixgemelinii；In vitro culture；Somatic embryogenesis

2016-02-18

黑龙江省属科研院所基本科研业务费专项“落叶松无性系扦插育苗配套技术研究”资助

田新华，女，硕士，副研究员，主要从事森林培育方面研究，E-mail:tianjie1976@sina.com；*通讯作者：翁海龙，硕士，副研究员，主要从事林木育种方面研究，E-mail:dl5529@gmail.com。

S436.611

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2016.04.005