牛肉中金黄色葡萄球菌的复核鉴定研究

皮志媛，何晓杰，叶尔保勒，阿斯喀，王振宝*

(1．伊犁职业技术学院，新疆伊宁 835000；2．伊犁出入境检验检疫局，新疆伊宁 835000)



牛肉中金黄色葡萄球菌的复核鉴定研究

皮志媛1，何晓杰1，叶尔保勒2，阿斯喀2，王振宝2*

(1．伊犁职业技术学院，新疆伊宁 835000；2．伊犁出入境检验检疫局，新疆伊宁 835000)

[目的]采用2种方法复核检出牛肉中金黄色葡萄球菌阳性结果，确保检测结果的准确性。[方法]按照GB 4789.10—2010《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》方法前增菌、选择性分离培养、革兰氏染色和血浆凝固酶试验鉴定金黄色葡萄球菌，应用SN/T 1870—2007《食品中致病菌检测方法 实时PCR法》对疑似阳性结果进行了进一步验证和复核。[结果]经过2种方法验证可疑菌落，该批牛肉中检出金黄色葡萄球菌。[结论]分离并鉴定牛肉中金黄色葡萄球菌可疑样品时，可采用不同方法进行验证和复核，该方法可提高检测结果的准确性，可用于畜禽肉中致病菌的检测。

金黄色葡萄球菌；复核鉴定；牛肉

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，是人和动物的常见病原菌，隶属葡萄球菌属(Staphylococcus)，革兰氏阳性菌，可引起多种严重感染，有“嗜肉菌”的别称，其所导致的食物中毒主要是由肠毒素引起的。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，在空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到[1-2]。由金黄色葡萄球菌引起食物中毒的食品主要有肉、蛋、乳及其制品等[3-4]。我国生鲜肉流通和运输环节包装简单或不包装，增加了其在运输、储存和消费过程中受到二次污染的机率，金黄色葡萄球菌成为我国肉品检测过程中重要的检测项目之一[5]。目前，对肉中金黄色葡萄球菌的检验大多采用GB 4789.10—2010《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》方法，按照前增菌、选择性分离培养、革兰氏染色和血浆凝固酶试验等流程鉴定金黄色葡萄球菌[6]，该方法由于受检测人员的专业水平和经验等多种因素的限制，容易出现误判[7]，且血浆凝固酶试验易受到金黄色葡萄球菌的培养时间、反应时间和体积等因素的影响，从而经常出现延迟凝固的现象，易造成漏检[8]。针对上述问题，为了提高检测结果的准确性，笔者对国标方法检出的牛肉中金黄色葡萄球菌可疑样品应用SN/T 1870—2007《食品中致病菌检测方法 实时PCR法》[9]进行了进一步验证和复核，以期为畜禽肉中致病菌的检测提供理论依据。

1　材料与方法

1.1样品选取送检的鲜牛肉样品进行试验。

1.2标准菌株与试剂金黄色葡萄球菌阳性菌株，由伊犁出入境检验检疫局实验室保存。7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker琼脂平板、脑心浸出液肉汤(BHI)、兔血浆、革兰氏染色液，均购自北京陆桥技术股份有限公司；金黄色葡萄球菌鉴定引物和探针、chelex 100粉末、PCR试剂等，均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.3仪器恒温培养箱(宾得400型)、实时荧光定量PCR仪(ABI 7500型)、天平(梅特勒MS1602S型)、均质器(AES EasyMix型)、离心机(贝克曼Allegra X-22R型)。

1.4样品的处理无菌操作取样，制成匀质检样，称取25 g匀质检样至盛有225 mL 7.5%氯化钠肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2 min，制成1∶10的样品匀液，用于金黄色葡萄球菌的检测。

1.5增菌将上述样品匀液于(36±1)℃下培养18～24 h。

1.6分离培养将上述培养物分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板(36±1)℃下培养18～24 h，Baird-Parker平板(36±1)℃下培养45～48 h，培养结束后观察菌落生长特征。

挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个及以上，接种到5 mL BHI，(36±1)℃下培养18～24 h。同时，进行革兰氏染色并镜检。

1.7血浆凝固酶试验取新鲜配制兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入BHI培养物0.2～0.3 mL，振荡摇匀，置于(36±1)℃温箱内，每30 min观察1次，观察6 h。同时，以金黄色葡萄球菌标准阳性菌株肉汤、阴性葡萄球菌菌株的肉汤和BHI肉汤空白培养基为对照。

1.8实时荧光定量PCR检测

1.8.1模板DNA的制备。

1.8.1.1增菌液模板DNA的制备。分别取“1.5”和“1.6”中培养的7.5%氯化钠肉汤增菌液和BHI培养物各1 mL，分别加入1.5 mL无菌离心管中，8 000 r/min离心5 min，弃上清；每管加入50 μL DNA提取液(使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取)，混匀后沸水浴5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清保存于-20 ℃下备用。

1.8.1.2可疑菌落模板DNA的制备。挑取“1.6”中Baird-Parker平板和血平板上的可疑菌落，分别加入50 μL DNA提取液，混匀后沸水浴5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清保存于-20 ℃，备用。

1.9实时荧光定量PCR检测

1.9.1实时荧光定量PCR反应体系。实时荧光定量PCR反应体系(25 μL)：10×PCR缓冲液2.5 μL、引物对(10 μmol/L)各1 μL、探针(10 μmol/L)1 μL、dNTP(10 mmol/L)1 μL、TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL、水16 μL、模板DNA 2 μL。

1.9.2实时荧光定量PCR反应条件。37 ℃ 5 min，95 ℃预变性3 min，94 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸40 s，同时收集FAM荧光，进行40个循环；4 ℃下保存。

1.9.3检测质控。检测过程中分别设置阳性对照(阳性菌株DNA)和空白对照(无菌水)。

2　结果与分析

2.17.5%氯化钠肉汤增菌样品匀液在7.5%氯化钠肉汤中于36.5 ℃条件下培养24 h，呈现混浊生长。

2.2分离菌在Baird-Parker和血平板上的培养特性在Baird-Parker平板上，菌落直径为2～3 mm，颜色呈灰色至黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有1个透明圈。用接种针接触菌落时，有似奶油至树胶样的硬度。在血平板上，菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、白色，菌落周围可见完全透明溶血圈。

2.3分离菌的革兰氏染色特征革兰氏阳性球菌，呈紫色，圆形，呈单个短链和葡萄串状排列，无芽孢、无荚膜，直径约为0.5～1.0 μm。

2.4血浆凝固酶试验标准阳性菌株和待检分离菌均使血浆凝固，将试管倾斜或倒置时呈现凝块，而阴性对照菌株和BHI肉汤空白培养基均无凝固现象，因此判定分离菌株的血浆凝固酶试验为阳性。

2.5实时荧光定量PCR检测分别对分离培养检样的7.5%氯化钠肉汤增菌液、BHI肉汤培养物、Baird-Parker平板和血平板上的可疑菌落进行了实时荧光定量PCR检测，阴性和阳性对照成立，样品Ct值≤35.0，判定样品检测结果均为阳性(图1)。

注：1．阳性对照；2．Baird-Parker平板上菌落；3．血平板上菌落；4．BHI肉汤培养物；5．7.5%氯化钠肉汤增菌液；6．空白对照(无菌水)。Note: 1. Positive control; 2．Colony on Baird-Parker agar plate; 3. Colony on blood plate; 4. Brain heart infusion (BHI) broth culture; 5. 7.5% sodium chloride broth culture; 6. Blank control (ddH2O).图1　实时荧光定量PCR检测结果Fig.1　The result of real-time fluorescent quantitative PCR

3　结论与讨论

笔者采用国家标准方法中选择性培养基细菌培养和分离、显微镜下形态学鉴定、溶血现象、血浆凝固酶试验等开展牛肉中金黄色葡萄球菌的检测，分离鉴定出牛肉中金黄色葡萄球菌可疑菌落，并运用实时荧光定量PCR方法进行了结果复核，检测结果相一致，确保了检测的准确性。陈丽丽等[10]建立了金黄色葡萄球菌分离鉴定的质量控制方法，采用血浆凝固酶试验、生化鉴定、实时荧光定量PCR等方法进行质控确证，验证了3种试验方法检测结果的相关性，试验表明菌株鉴定时可采取多种检测方法，以提高检测结果的准确性。

为确保检测结果的准确性，在实际检测工作中分离并鉴定金黄色葡萄球菌可疑样品时，可采用不同的试验方法进行验证和复核，该研究结果对畜禽肉中致病菌的准确检测具有参考价值和指导意义。

[1] 孙燕萍．对畜禽生肉及养殖环境表面分离的金黄色葡萄球菌的药敏分析[J]．中国药物经济学，2015(3)：178-179．

[2] 郑向梅，吕均，李玉芳，等．规模化养猪场金黄色葡萄球菌污染状况调查分析[J]．中国卫生检验杂志，2012，22(12)：2986-2987．

[3] 李娇，董庆利，陆柏益，等．国内外原料乳中金黄色葡萄球菌风险评估研究综述[J]．乳业科学与技术，2015，38(1)：26-31．

[4] 周少君，梁辉，朱海明，等．广东省熟肉制品中金黄色葡萄球菌的污染调查及初步风险评价[J]．中国食品卫生杂志，2014，26(5)：496-500．

[5] 李苗云，惠利娜，赵改名，等．荧光定量PCR检测生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的应用研究[J]．河南农业大学学报，2014，48(4)：475-480．

[6] 中华人民共和国卫生部.食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验：GB 4789.10—2010[S]．北京：中国标准出版社，2010.

[7] 姜侃，吕沁风，汪新，等．三重LAMP法检测食品中沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌[J]．食品科学，2013，34(24)：182-187．

[8] 刘真真，林涛，李光伟，等．金黄色葡萄球菌不同培养与反应条件对其血浆凝固酶的影响[J]．检验检疫科学，2005(5)：34-35．

[9] 国家认证认可监督管理委员会.食品中致病菌检测方法 实时PCR法：SN/T 1870—2007[S]．北京：中国标准出版社，2007.

[10] 陈丽丽，刘丽萍，徐岚．镇江市食源性金黄色葡萄球菌检测质量控制研究[J]．中国卫生检验杂志，2015，25(5)：655-657．

Study on Identification ofStaphylococcusaureusfrom Beef

PI Zhi-yuan1, HE Xiao-jie1, YE’ER Bao-le2, WANG Zhen-bao2*et al

(1. Yili Vocational and Technical College, Yining, Xinjiang 835000; 2. Yili Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Yining, Xinjiang 835000)

[Objective] Two methods were used to review positive results ofStaphylococcusaureusfrom beef to ensure the accuracy of test results. [Method] According to theFoodMicrobiologicalExamination:StaphylococcusaureusTest(GB 4789.10—2010),S.aureusfrom beef was identified through propagation of bacteria, selective separation culture, Gram staining, and plasma coagulase test, and the suspected positive results ofStaphylococcusaureusfrom beef were verified and reviewed according to theDetectionofPathogensinFood—Real-timePCRMethod(SN/T 1870—2007). [Result] The identification of questionable colony by the two methods indicated that there wasS.aureusin beef. [Conclusion] The two methods can be used to verify and review the identification results of suspected samples ofS.aureusfrom beef, and they are more accurate and can be used to detect pathogens in livestock and poultry meat.

Staphylococcusaureus; Identification; Beef

伊犁州直科学研究与技术开发计划项目(YZ201302017)。

皮志媛(1987- )，女，天津人，助教，硕士，从事动物检验检疫工作。*通讯作者，兽医师，硕士，从事动物检验检疫工作。

2016-05-16

S 851.34+7

A

0517-6611(2016)19-176-02