蛋鸡群沙门氏菌的监测

吕殿红，温肖会，翟少伦，黄 忠，杨燕秋，周秀蓉，魏文康

(广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东广州 510640)



蛋鸡群沙门氏菌的监测

吕殿红，温肖会，翟少伦，黄 忠，杨燕秋，周秀蓉，魏文康*

(广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东广州 510640)

[目的]了解蛋鸡场沙门氏菌的感染情况。[方法]采用沙门氏菌抗原和抗体检测方法对2012～2015年采集的广东省蛋鸡场样品进行检测。采用ELISA方法对1784血清样品进行了肠炎沙门氏菌和1 387份血清样品进行了鼠伤寒沙门氏菌抗体检测；采用凝集试验方法对1 391份血清样品进行了鸡白痢沙门氏菌抗体检测；采用细菌培养、PCR方法对采自广东省的活鸡/死鸡、环境拭子等1 458份样品进行了沙门氏菌检测。[结果]肠炎、鼠伤寒、鸡白痢3种血清型沙门氏菌抗体的阳性率分别为16.70%、10.09%和1.01%；沙门氏菌抗原检测的阳性率为1.65%。[结论]蛋鸡群中存在肠炎、鼠伤寒、鸡白痢等3种沙门氏菌不同程度的感染，但是蛋鸡群的总体感染率不高。

沙门氏菌；感染；抗体；阳性率

沙门氏菌是常见的肠道病原菌之一，在自然界分布广泛、种类繁多，目前已检测出沙门氏菌血清型2 500余种，据报道在我国存在的血清型有292种[1]。沙门氏菌所导致的疾病统称沙门氏菌感染。沙门氏菌不仅能引起动物发生急性、慢性或隐性感染，而且还能通过污染食物导致人的食物中毒，引发败血症等，对人类健康造成很大的威胁。在世界各国的各类细菌性食物中毒事件中，沙门氏菌引起的食物中毒常居榜首。2000年，在科技部和卫生部的支持下，中国疾病预防控制中心营养与食品安全所建立的全国食品污染物监测体系对食品中的污染物进行了连续主动监测，食源性致病菌的监测指标选取沙门氏菌，这是因为在我国内陆地区细菌性食物中毒的暴发例数和发病人数多年来排第1位就是沙门氏菌感染。沙门氏菌是公共卫生意义上具有重要意义的人兽共患病原菌之一，最为常见的人兽共患的沙门氏菌有鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌等。我国城乡居民对鸡蛋的消耗量占禽蛋消费量的85%以上，近十多年来年消耗量都超过2 000万t[2]，如果蛋鸡场存在沙门氏菌的污染，将直接影响到鸡蛋的质量，对人民健康存在巨大的威胁，因此加强蛋鸡场的沙门氏菌监测十分重要。笔者于2012年7月至2015年12月对广东省部分地区蛋鸡群进行沙门氏菌监测，以期为沙门氏菌的净化和预防提供依据。

1　材料与方法

1.1样品采集 来自广东省的不同鸡场115批次样品，采集时间为2012年7月至2015年12月底。用于检测肠炎沙门氏菌抗体的鸡血清样品1 784个，用于检测鼠伤寒沙门氏菌抗体的样品1 387份，用于检测鸡白痢沙门氏菌抗体1 391份；供检测沙门氏菌的样品1 458份，包括1日龄～56周龄的活鸡1 222只、死亡鸡48只、鸡场环境拭子16份、环境和鸡粪混合样品128份、垫纸44份。以上商品代鸡场均为存栏量超过10万只以上的鸡场。样品来源和数量等具体见表1。

1.2样品处理对用于抗原检测的活鸡、死亡鸡样品无菌取内脏及肠内容物剪碎，加入灭菌的PBS充分研磨；将环境拭子直接置于灭菌的PBS中混匀；环境和鸡粪混合样品以及垫纸捣碎后与无菌PBS充分混合，过滤后取上清待用。

对上述PBS混合液进行增菌处理：取1 mL接种于10 mL四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)内，于(42±1)℃培养18～24 h。同时，另取1 mL接种于10 mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)内，于(36±1)℃培养18～24 h。

1.3试剂/试剂盒、引物和沙门氏菌阳性菌 肠炎沙门氏菌抗体(SE-Ab)和鼠伤寒沙门氏菌抗体(ST-Ab)试剂盒均为荷兰Biochek公司产品(由北京天之泰生物科技有限公司提供)；鸡白痢凝集抗原、阳性血清、阴性血清，均购自北京中海科技有限公司；沙门氏菌培养基TTB和SC、显色培养基均为广东环凯微生物科技有限公司产品。针对沙门氏菌侵袭蛋白 A(invasionprotein A，invA)基因，参考文献[3]方法设计PCR引物，由上海英潍捷基生物有限公司合成。沙门氏菌阳性菌株，购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.4抗体水平检测

1.4.1肠炎沙门氏菌抗体和鼠伤寒沙门氏菌抗体的ELISA检测。 血清样品按1∶100的比例进行稀释，将100 μL稀释后的样品添加到相应的酶标板孔内，室温孵育30 min，倒出孔内容物，洗涤4次，最后1次倒转反应板，在吸水纸上轻轻拍打。然后，每孔添加100 μL酶标二抗，室温孵育30 min，洗涤4次；每孔加入100 μL底物，室温下孵育15 min；加入100 μL终止液，终止反应，调零，使用酶标仪于405 nm波长处测定各孔吸光值。检测时设置阳性和阴性对照，当阴性对照的平均吸光度小于0.3，阳性对照的平均吸光度大于等于0.3，二者之间的差值大于0.15，说明检测结果可靠。S/P值=(待检样品的平均吸光度-阴性样品的平均吸光度)/(阳性样品的平均吸光度-阴性样品的平均吸光度)。若S/P值≤0.499，说明样品抗体为阴性；若S/P值≥0.500，说明样品抗体值为阳性。

1.4.2鸡白痢抗体检测。采用平板凝集方法，用吸管吸取抗原50 μL，垂直滴加在洁净玻璃板上，然后吸取50 μL鸡血清,与抗原充分混合均匀，并使其散开至直径为2 cm。不断摇动玻璃板，计时判定结果，同时设置强阳性血清、弱阳性血清、阴性血清对照。

1.5抗原检测取增菌液在沙门氏菌鉴别培养基上划线，结合培养特性，取可疑菌落接种至LB液体培养基内，提取DNA。以提取的DNA为模板，采用PCR方法[3]进行验证试验，扩增的目的片段为403 bp。

2　结果与分析

对采集的血清样品进行肠炎沙门氏菌抗体、鼠伤寒沙门氏菌抗体、鸡白痢抗体检测，不同时期几种抗体的阳性率不同(表1)。沙门氏菌在沙门氏菌鉴别培养基上呈现特征的紫红色圆形菌落(图1)，挑取疑似菌落进行PCR验证，均出现目的条带。沙门氏菌PCR鉴定的结果见图2，沙门氏菌的分离情况及分离率见表1。

表1　不同来源样品几种沙门氏菌抗体和沙门氏菌的检测结果

图1　沙门氏菌在沙门氏菌鉴别培养基上的观察结果Fig.1　Observation results of salmonella in differential mediums

注：M.DNA 标准DL2000；1～8.沙门氏菌鉴别培养基上疑似阳性样品；9.阳性对照；10.阴性对照。Note：M.DNA marker DL2000; 1-8.Suspected samples in differential mediums; 9.Positive control; 10.Negative control.图2　部分沙门氏菌阳性样品的PCR验证结果Fig.2　Results of PCR verification of salmonella positive samples

3　讨论与结论

沙门氏菌是1885年由沙门氏等在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，因此定名为沙门氏菌属。沙门氏菌的存在严重威胁着人民的身体健康和畜牧业的健康发展其在养殖场的存在也时有报道[4-9]，对养殖业的危害很大，另外由于兽药的滥用，导致沙门氏菌耐药性的增强[10-11]，给该病的防治带来很大困难。实时跟踪监测对于有效防止沙门氏菌感染的扩散、为畜禽产品的安全提供有效保障。

该研究结果表明，广东省部分地区蛋鸡群中存在肠炎、鼠伤寒、鸡白痢等几种沙门氏菌的感染，但是鸡群总体感染率不高。这可能与监测样品多数来自大型鸡场有关，大型鸡场管理相对完善、饲养条件相对较好使沙门氏菌的流行传播受阻。相对而言，小型鸡场及散养鸡环境较差条件较简陋，容易流行和爆发沙门氏菌[12]，因此对小型鸡场沙门氏菌的监测和防控将是今后工作的重点，建议相关部门和机构加以重视。

2012年监测结果表明，父母代的鸡场环境中检测到沙门氏菌，因此在2013年加大对鸡场血清中3种沙门氏菌抗体的监测力度，并且对鸡群加强饲养管理、对鸡场生物安全等方面加大防控力度，2015年已经获得改善。这充分说明了加强饲养管理和防控措施等对控制动物疫病的重要性。

该研究中检出的沙门氏菌的24个阳性样品，包括18个环境拭子和6个来自雏鸡的肝脏和卵黄中的样品。这与文献[13-14]的报道相一致。笔者未对鸡二蛋和蛋壳上的沙门氏菌进行监测，但是蛋鸡场沙门氏菌的存在必然导致鸡蛋的污染机会增多，据报道鸡蛋和鸡蛋壳沙门氏菌的污染率不低[15]，人们在食用鸡蛋时接触蛋壳，很容易造成间接感染，因此建议鸡蛋食用前进行清洁处理。虽然我国人民习惯吃熟食，但是随着中西文化的交流，一些外来饮食习惯(如生食等)逐渐被国人接受，因此加强沙门氏菌的控制十分重要，应切断其传播途径，保障人类和动物健康。

[1] 彭海滨，吴德峰，孔繁德，等.我国沙门菌污染分布概况[J].中国国境卫生检疫杂志，2006，29(2)：125-128.

[2] 王静怡，陈珏颖，刘合光.中国鸡蛋消费现状和影响因素分析[J].农业展望，2015(1)：75-80.

[3] 杨保伟.食源性沙门氏菌特性及耐药机制研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2010.

[4] 蒋培红.沙门氏菌的危害及其对畜产品污染的控制策略[J].中国动物检疫，2007，24(10)：22.

[5] FOLEY S L，LYNNE A M，NAYAK R． Salmonella challenges：Prevalence in swine and poultry and potential pathogenicity of such isolates[J]．Journal of animal science，2008，86(14)：149-162.

[6] 王亮，张元鹏，张荣武，等.鸡源性肠炎沙门氏菌的流行病学调查[J].中国人兽共患病学报，2011，27(5)：455-458.

[7] 吕殿红，张毓金.樱桃谷鸭感染猪霍乱沙门氏菌的分离鉴定[J].中国预防兽医学报，2002，24(4)：283-285.

[8] 蒋清蓉，张德胜，赖守勋，等.四川地区蛋鸡孵化场沙门氏菌调查[J].四川畜牧兽医，2012(4)：20-21.

[9] 陈玲，张菊梅，杨小鹃，等.南方食品中沙门氏菌污染调查及分型[J].微生物学报，2013，53(12)：1326-1333.

[10] 黄凯，陈素娟，黄骏，等.动物源性沙门氏菌的耐药性分析及氟苯尼考类耐药基因的鉴定[J].中国畜牧兽医，2015，42(2)：459-466.

[11] CHIU C H，WU T L，SU L H，et al.The emergence in Taiwan of fluoroquinolone resistance inSalmonellaentericaserotype Choleraesuis[J]．New England journal of medicine，2002，346(6)：413-419．

[12] 尹晓楠，陈晶，田祥宇，等.北京郊区散养鸡及鸡蛋沙门氏菌带菌情况调查[J].中国动物检疫，2013，23(10)：61-65.

[13] SANTOS D M，BERCHIERI J A，FERNADES S A，et al.Salmonellaem em carcacas de frongo congeldas[J].Pesquisa veterinaria brasileira，2000，20(1)：39-42.

[14] KANASHIRO A M I，STOPPA G C，CARDOSO A，et al.Serovars ofSalmonellaspp isolated from broiler chickens and commercial breeders in diverse regions in Brazil from July 1997 to December 2004[J].Revista brasileira de ciencia avicola，2005，7(3)：195-198.

[15] 王晶钰，董睿，王利勤，等.市售鲜鸡蛋中沙门氏菌的分离鉴定及毒力岛基因检测[J].食品科学，2012(16)：154-158.

Monitoring of Salmonella in Laying Hens

LU Dian-hong, WEN Xiao-hui, ZHAI Shao-lun, WEI Wen-kang*et al

(Institute of Veterinary Medicine, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of Livestock Disease Prevention, Guangzhou, Guangdong 510640)

[Objective] To study infection of laying hens with salmonella. [Method] The antigen and antibody of salmonella in laying hens collected from Guangdong Province during 2012-2015 were detected. ELISA method and aggregation test were used to detect the antibody titer of serum samples aboutSalmonellaenteritidis,SalmonellatyphimuriumandSalmonellapullorum, and then germiculture and PCR were used to check out salmonella from chickens and environment swabs. [Result] Positive rates of three kinds of antibody were 16.70%, 10.09% and 1.01% respectively, while the positive rate of salmonella antigen was 1.65%. [Conclusion] The laying hens are infected with the three kinds of salmonella, but their infection rates were not high on the whole.

Salmonella; Infection; Antibody; Positive rate

广东省促进科技服务业发展计划项目(2012B040302010)；广东省技术交易体系与科技服务网络建设领域项目(2014B040404061，2016A040401012)；广东省科技创新创业人才服务领域项目(2014A070713020)。

吕殿红(1969- )，女，安徽来安人，高级兽医师，博士，从事预防兽医学研究。*通讯作者，研究员，博士，硕士生导师，从事预防兽医学研究。

2016-05-30

S 85

A

0517-6611(2016)19-163-03