3，5-二羟基甲苯与L-肌肽对酪氨酸酶的抑制作用

刘 临，黄 浩

(1.江西宜春学院化学与生物工程学院，江西宜春 336000；2.江西宜春学院应用化学与化学生物学重点实验室，江苏宜春 336000)



3，5-二羟基甲苯与L-肌肽对酪氨酸酶的抑制作用

刘 临1，2，黄 浩1，2

(1.江西宜春学院化学与生物工程学院，江西宜春 336000；2.江西宜春学院应用化学与化学生物学重点实验室，江苏宜春 336000)

[目的]研究3，5-二羟基甲苯与L-肌肽对酪氨酸酶活性的抑制作用。[方法]从新鲜蜜梨中提取酪氨酸酶，以邻苯二酚为底物，研究3，5-二羟基甲苯、L-肌肽对酪氨酸酶活性的影响。[结果]3，5-二羟基甲苯与L-肌肽对酪氨酸酶均有一定的抑制作用。[结论]L-肌肽对酪氨酸酶的抑制作用强于3，5-二羟基甲苯。

酪氨酸酶；3，5-二羟基甲苯；L-肌肽；抑制率

酪氨酸酶(EC1.14.18.1)[1-3]又称多酚氧化酶，是黑色素代谢的关键酶，存在于植物、人和动物等多种生物组织中。黑色素对皮肤颜色和色素的沉积起决定性作用。它是一种金属酶，含有铜离子，构成酪氨酸酶催化反应的活性中心，能够催化单酚和二酚氧化成醌，并使醌在非酶促条件下形成终产物黑色素[4]。皮肤美白剂种类繁多，其中一大类通过抑制皮肤酪氨酸酶活性或阻断生成黑色素的氧化反应，从而减少黑色素的生成达到增白美肤之效。皮肤美白剂的开发研究已成为推动美容护肤化妆品发展的一个重要方向，该类美白剂对酪氨酸酶活性抑制作用的强弱成为衡量其美白效果的重要指标[5-6]。

蜜梨酪氨酸酶具有单酚羟化酶和二酚加氧酶双酶活性，单酚酶可以先羟化酪氨酸产生邻二羟基苯丙氨酸(即L-多巴)，二酚酶再将其氧化成为相应的多巴醌，进一步反应后生成一系列引起褐化的色素类物质[7]。笔者通过酪氨酸酶催化反应后生成醌，而醌有颜色，在某个可见波长上有明显吸收峰。生成醌的量越多，在此可见波长上的吸收值越大。同等条件下，加入3，5-二羟基甲苯、L-肌肽后醌的生成量会减少，在此可见波长上的吸收值变小。笔者以邻苯二酚代替酪氨酸为底物，研究3，5-二羟基甲苯、L-肌肽对酪氨酸酶的抑制作用。

1　材料与方法

1.1材料供试材料为市场上购买的新鲜蜜梨。

1.2主要试剂3，5-二羟基甲苯(国药集团化学试剂有限公司，化学纯)，L-肌肽(天津一方科技有限公司，对照品)，邻苯二酚(天津市永大化学试剂有限公司，分析纯)，丙酮、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠(国产分析纯)。

1.3主要仪器TGL20M高速台式冷冻离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)，Lamada35紫外可见分光光度计(美国PE)，JJ-2B组织捣碎匀浆机(常州华冠仪器有限公司)，JB-5定时双向恒温磁力搅拌器(常州华冠仪器有限公司)，BSA224S-CW电子分析天平(上海皖宁精密科学仪器有限公司)，HH-4数显恒温水浴箱(国华电器)。

1.4方法

1.4.1酪氨酸酶的提取。

1.4.1.1 丙酮粉的制备[8]。取新鲜蜜梨果肉组织200 g，用塑料刀切碎块放入高速组织捣碎机，同时加入冰丙酮320 mL(-25 ℃预泠)，搅拌8 min，混合液真空抽滤，直至成白色粉末，即得丙酮粉，-25 ℃下保存。

1.4.1.2酪氨酸酶液的制备。称取丙酮粉4 g，加入80 mL磷酸缓冲液(pH 6.5)[9]，在-1 ℃下用磁力搅拌机匀浆40 min，放入冰冻高速离心机于-1 ℃、12 000 r/min离心40 min，取上清液即得酪氨酸酶粗提液。

1.4.2以邻苯二酚为底物的酪氨酸酶最大吸收波长的确定。在比色杯中用微量移液管加入0.2 mL酶液，再将3.0 mL邻苯二酚溶液(0.2 mol/L)用移液管加入，以3.0 mL邻苯二酚溶液(0.2 mol/L)中加入0.2 mL双蒸馏水为对照，在波长375～600 nm测定吸光度变化。

1.4.3抑制剂对酪氨酸酶的抑制。

1.4.3.1不同浓度3，5-二羟基甲苯对酪氨酸酶的抑制[10]。用pH 6.5的磷酸缓冲液配制0.2 mol/L的邻苯二酚和1.0、3.0、5.0、8.0、10.0 mmol/ L的3，5-二羟基甲苯。

在比色杯中按顺序加入0.1 mL酶液、0.1 mL蒸馏水、2.8 mL邻苯二酚(0.3 mol/L)，以2.8 mL邻苯二酚(0.2 mol/L)中加入0.2 mL双蒸馏水为对照，立即于425 nm处扫描，并记录30 s处的OD值(A)。

在比色杯中按顺序加入0.1 mL酶液、0.1 mL各浓度的3，5-二羟基甲苯(分别做5个浓度的试验)，再加入2.8 mL邻苯二酚(0.2 mol/L)，以2.8 mL邻苯二酚(0.3 mol/L)中加入0.2 mL双蒸馏水为对照，立即于425 nm处进行扫描，并记录30 s处的OD(B)。

3，5-二羟基甲苯以邻苯二酚为底物对酪氨酸酶的抑制率计算公式：I=(A-B)/A×100%。

1.4.3.2不同浓度L-肌肽(L-camosine)对酪氨酸酶的抑制[11]。用pH 6.5的磷酸缓冲液分别配制0.1、0.25、0.50、0.75、1.0 mmol/ L的L-肌肽。在比色杯中按顺序加入0.1 mL酶液、0.1 mL各浓度的L-肌肽(分别做5个浓度的试验)，再加入2.8 mL邻苯二酚(0.2 mol/L)，以2.8 mL邻苯二酚(0.3 mol/L)中加入0.2 mL双蒸馏水为对照，立即于425 nm处进行扫描，并记录30 s处的OD值(C)。

L-肌肽以邻苯二酚为底物对酪氨酸酶的抑制率计算公式：I=(A-C)/A×100%。

2　结果与分析

2.1酪氨酸酶的最大吸收波长经紫外可见分光光度计在波长375～600 nm处扫描，结果见图1。由图1可知，以邻苯二酚为底物，在425 nm处有最大吸收峰，故蜜梨酪氨酸酶以邻苯二酚为底物时，最大吸收波长为425 nm。

图1　酪氨酸酶以邻苯二酚为底物的吸收波长Fig.1　Absorption wavelength of tyrosinase with catechol as substrate

2.2以邻苯二酚为底物时2种药物对酪氨酸酶的影响

2.2.1不同浓度3，5-二羟基甲苯对酪氨酸酶的抑制。由图2可知，3，5-二羟基甲苯对酪氨酸酶的抑制作用与浓度相关，浓度越大，抑制效果越明显。当3，5-二羟基甲苯浓度达10 mmol/L时，其对酪氨酸酶的抑制率可达66.69%。

图2　3，5-二羟基甲苯浓度与抑制率Fig.2　3,5-dihydroxytoluene concentration and inhibition rate

2.2.2不同浓度L-肌肽对酪氨酸酶的抑制。由图3可知，L-肌肽对酪氨酸酶的抑制作用分为低浓度组(L-肌肽浓度在0.5 mmol/L以下)和高浓度组(L-肌肽浓度在0.5 mmol/L以上)，2种浓度的效果不同。L-肌肽低浓度组基本上对酪氨酸酶无抑制作用，L-肌肽高浓度组，浓度越大对酪氨酸酶的抑制作用越强。当L-肌肽浓度为1 mmol/L时，其对酪氨酸酶的抑制率为21.25%。

图3　L-肌肽浓度与抑制率 Fig.3　L-camosine concentration and inhibition rate

3　结论与讨论

3，5-二羟基甲苯又名苔黑酚或地衣酚，是一种重要的有机合成中间体，临床上可做消炎药，在医药领域有广泛应用。L-肌肽是由β-丙氨酸和组氨酸构成的二肽(β-Ala-L-His)，临床可做抗白内障药物。以酪氨酸酶筛选化妆品美白添加剂时，经试验比较，选择从蜜梨提取酪氨酸酶，其酶活力较强，酶的最适pH和热稳定性接近，但与从雪梨中提取的酪氨酸酶最大吸收波长有所不同[12]。由于酶活性对作用条件温和的特殊要求，酪氨酸酶的提取和酶活测定极其重要，它直接关系到后面一系列试验结果的准确性，因此，整个过程要严格按照要求进行试验操作。

该研究结果表明，3，5-二羟基甲苯、L-肌肽对酪氨酸酶均有一定的抑制作用；在相同浓度下(3，5-二羟基甲苯、L-肌肽2种药剂的浓度均为1 mmol/L时)，L-肌肽对酪氨酸酶的抑制作用(抑制率为21.25%)高于3，5-二羟基甲苯(抑制率为6.88%)。以邻苯二酚为底物，L-肌肽对酪氨酸酶的抑制作用强于3，5-二羟基甲苯，且二者的抑制率均随着浓度的增大而增大。该研究为2种药剂作为化妆品美白添加剂以抑制黑色素的形成、祛除皮肤色斑提供了理论依据[12]。

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Inhibition Effect of 3,5-dihydroxytoluene and L-camosine on Tyrosinase Activity

LIU Lin1,2, HUANG Hao1,2

(1. College of Biological and Chemical Engineering, Yichun University, Yichun, Jiangxi 336000; 2. Key Laboratory of Jiangxi University for Applied Chemistry and Chemical Biology, Yichun University, Yichun, Jiangxi 336000)

[Objective] To study the inhibition effect of 3,5-dihydroxytoluene (DHT) and L-camosine on tyrosinase activity. [Method] The effects of 3,5-dihydroxytoluene and L-camosine on the activity of tyrosinase extracted from fresh snow pear were analyzed with catechol as substrate. [Result] Both 3,5-dihydroxytoluene and L-camosine had certain inhibition effect on tyrosinase activity. [Conclusion] The inhibition effect of L-camosine on tyrosinase activity was stronger than that of 3,5-dihydroxytoluene.

Tyrosinase; 3,5-dihydroxytoluene; L-camosine; Inhibition rate

刘临(1964- )，男，江西高安人，高级实验师，从事分析化学教学与研究。

2016-05-09

Q 55

A

0517-6611(2016)19-119-02