反复冻融法对枸杞多糖溶出率的研究

温梓辰，荣 雪，郭乃菲，陈点点，王慧妍，胡 丹，刘广斌

(辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600)



反复冻融法对枸杞多糖溶出率的研究

温梓辰，荣 雪，郭乃菲*，陈点点，王慧妍，胡 丹，刘广斌

(辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600)

[目的] 探究反复冻融法对枸杞多糖溶出率的影响。[方法]通过对解冻温度、冻结时间、冻融次数、冻结温度进行单因素试验及正交试验，验证反复冻融法对枸杞多糖的提取效果影响。[结果] 当温度低于45 ℃时，枸杞多糖的溶出率随温度的升高而升高，当温度高于45 ℃时，枸杞多糖的溶出率却降低；随着冻融次数的增多，枸杞多糖的溶出率逐渐增大，但超过3次以后溶出率提升并不明显；随着冻结时间的增长，枸杞多糖的溶出率逐渐增大，当冻结时间超过3 h后，枸杞多糖溶出率趋于平稳，无明显变化；随着冻结温度的降低，枸杞多糖的融出率逐渐增大，当冻结温度低于-24 ℃后，枸杞多糖融出率趋于平稳，无明显变化。[结论] 反复冻融法提取枸杞多糖的最佳工艺组合为：解冻温度45 ℃，冻融次数4次，冻结时间3 h，冻结温度-28 ℃。

枸杞多糖；反复冻融；溶出率；提取

枸杞既是传统名贵中药材，又是一种营养滋补品，市场上多以干品的形式进行交易，枸杞多糖可以改善老年人易疲劳、食欲不振和视力模糊等症状[1-2]，并具有降血脂、降血糖[3-4]、抗脂肪肝、抗衰老、抗肿瘤等作用[5-6]，但是，纯品提取繁杂，价格昂贵。枸杞多糖粗品较纯品相比，提取简便，方便实验探究。反复冻融法是利用冻结—解冻过程中枸杞细胞内部的冰晶体对细胞壁的机械作用而使其破裂的一种物理方法[7-8]，该法实验操作简单、环保，有利于保护多糖结构，提高多糖的生物利用率[9]。反复冻融所需条件在现代工业生产中比较容易获得，为探究新的枸杞多糖提取方式，该文对反复冻融法与枸杞多糖溶出率之间的关系进行探讨。

1　材料与方法

1.1材料与设备枸杞子，葡萄糖(标准品)，苯酚(分析纯)，硫酸(分析纯)，石油醚(分析纯)，电子天平，紫外-可见分光光度计(UVmini-1240)，水浴锅，冰箱。

1.2方法

1.2.1样品处理。取枸杞子干品0.1 g，置于小瓷杯中，加水1 mL，溶胀20 min后，置于冰箱冷冻室冷冻，一段时间后取出，放入水浴锅中解冻20 min，将溶胀的枸杞与溶液一并倒入250 mL圆底烧瓶中，加入100 mL石油醚在48 ℃水浴的情况下回流1 h，过滤，于分液漏斗中分液，弃去有机层，剩余溶液与枸杞一并倒入250 mL圆底烧瓶中，加水150 mL，98 ℃水浴回流2 h，静置冷却后取1 mL溶液滴入250 mL容量瓶中，定容[10-11]。

1.2.2多糖含量测定。使用苯酚—硫酸法测定多糖[12]。

1.2.2.1标准曲线的绘制。精密称取0.025 g葡萄糖标准品，置于250 mL量瓶中，定容至刻线，摇匀，作为葡萄糖标准品溶液(0.1 mg/mL)待用。准确吸取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于试管中，各加入蒸馏水，使其体积为2.0 mL，再加入6%苯酚1.0 mL，并迅速滴加浓硫酸5.0 mL，充分振荡摇匀之后静置15 min后，40 ℃水浴15 min。另外以蒸馏水2.0 mL，加苯酚和浓硫酸同上述操作做空白对照，于波长490 nm 处测吸光度值，得标准曲线。

1.2.2.2可溶性多糖溶出率的测定。 按“1.2.1”工艺处理样品后，经显色，在490 nm下测定吸光值，可计算可溶性多糖的溶出率。

可溶性多糖溶出率=[可溶性多糖质量(g)×稀释倍数]/样品质量(g)×100%

={[(A+0.064 6)×51 250]/(1.298 3×106×M)}×100%

式中：A为吸光度，M为样品质量。

2　结果与分析

2.1葡萄糖标准曲线试验测得葡萄糖标准曲线(图1)。

图1　葡萄糖标准曲线Fig.1　Standard curve of glucose solution

2.2解冻温度对枸杞多糖溶出率的影响共设5种解冻温度处理，分别为30、45、60、75、90 ℃，在冻结时间1 h、冻结温度-20 ℃，冻融1次的情况下实验，测得枸杞多糖溶出率，结果见图2。由图2可知，解冻温度对枸杞多糖的溶出率影响较为显著。当温度低于45 ℃时，枸杞多糖的溶出率随温度的升高而升高，当温度高于45 ℃时，枸杞多糖的溶出率却降低了。分析认为过高温度易使枸杞多糖降解，而温度不够又会导致细胞壁破裂不充分，可溶性多糖溶出率降低[13]。

图2　解冻温度对枸杞多糖溶出率的影响Fig.2　Effect of thawing temperature on dissolving rate of Goji Berry polysaccharide

2.3冻融次数对枸杞多糖溶出率的影响共设5种冻融次数处理，分别为1、2、3、4、5次，在冻结时间1 h，冻结温度-20 ℃，解冻温度30 ℃的情况下实验，测得枸杞多糖溶出率，结果见图3。由图3可知，随着冻融次数的增多，枸杞多糖的溶出率逐渐增大，但超过3次以后溶出率提升并不明显，分析认为，枸杞细胞结构经过3次冻融后基本被破坏，故对溶出率无明显影响。

图3　冻融次数对枸杞多糖溶出率的影响Fig.3　Effects of freezing-thawing times on dissolving rate of Goji Berry polysaccharide

2.4冻结时间对枸杞多糖溶出率的影响共设6种冻结时间处理，分别为1、2、3、4、5、6 h，在冻结温度-20 ℃，解冻温度30 ℃，冻融1次的情况下实验，测得枸杞多糖溶出率，结果如图4。由图4可知，随着冻结时间的增长，枸杞多糖的溶出率逐渐增大。当冻结时间超过3 h后，枸杞多糖溶出率趋于平稳，无明显变化。分析认为，冻结3 h以上后，细胞内冰晶增长趋于饱和[14]，故对枸杞多糖溶出率无明显影响。

图4　冻结时间对枸杞多糖溶出率的影响Fig.4　Effect of freezing time on dissolving rate of Goji Berry polysaccharide

2.5冻结温度对枸杞多糖溶出率的影响共设6种冻结温度处理，分别为-20、-22、-24、-26、-28、-30 ℃，在冻结时间1 h，解冻温度30 ℃，冻融1次的情况下实验，测得枸杞多糖溶出率，结果如图5。由图5可知，随着冻结温度的降低，枸杞多糖的融出率逐渐增大。当冻结温度低于-24 ℃后，枸杞多糖融出率趋于平稳，无明显变化。分析认为，冻结温度低于-24 ℃后，冰晶形成在细胞内部的比值达到最大[15]，无法对细胞壁的破坏做更多贡献，故枸杞多糖融出率趋于平稳。

图5　冻结温度对枸杞多糖溶出率的影响Fig.5　Effects of freezing temperature on dissolving rate of Goji Berry polysaccharide

2.6正交实验为选择反复冻融法对枸杞多糖最佳溶出工艺条件，设计以解冻温度、冻融次数、冻结时间、冻结温度为考察因素，以枸杞多糖的溶出率为考察目标的L9(34)正交试验，因素水平见表1。经过试验，结果见表2。

以表3的方差分析为依据，选取冻结时间作为误差估计项，研究结果表明，解冻温度对枸杞多糖融出率有显著影响。由表2可知，各因素对枸杞多糖融出率的影响是不同的，4个因素对枸杞多糖融出率的影响大小顺序依次为：A>D>C>B。经过极差分析发现，反复冻融法提取枸杞多糖的最佳工艺组合为A2B3C2D3，即：解冻温度45 ℃，冻融次数4次，冻结时间3 h，冻结温度-28 ℃时，枸杞多糖融出率较高，在该工艺下做验证试验，得到3组数据：15.653%、15.644%、15.655%，验证的平均值为15.651%。

表1　正交实验因素水平

表2　正交试验结果

表3　方差分析

3　结论

(1)各因素对枸杞多糖溶出率的影响顺序为：解冻温度>冻结温度>冻结时间>冻融次数。

(2)分析认为，解冻温度直接影响枸杞多糖的结构完整性，故解冻温度为主要影响因素。冻结温度虽然不会破坏枸杞多糖的结构，但直接影响冰晶的大小；冻结时间决定冰晶的数量，但低温冻结生成的小冰晶对细胞壁破坏贡献低，数量不足以弥补大小带来的差距；冻融次数虽然越多越好，但多次冻融耗费时间，贡献小，得不偿失。

(3)反复冻融法提取枸杞多糖的最佳工艺组合是：解冻温度45 ℃，冻融次数4次，冻结时间3 h，冻结温度-28 ℃，在该条件下，枸杞多糖融出率可达到15.651%。

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Technique of Extracting Polysaccharides from Goji Berry by Repeated Freezing and Thawing Method

WEN Zi-chen ,RONG Xue, GUO Nai-fei*et al

(College of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian, Liaoning 116600)

[Objective] To study the effects of repeated freezing and thawing method on rate of extracting polysaccharides from Goji Berry. [Methods] Single factor experiment and orthogonal test were carried out for thawing temperature, freezing time, freezing and thawing times, and freezing temperature, to verify the effects of repeated freezing and thawing method on rate of extracting polysaccharides from Goji Berry. [Results] When the temperature was lower than 45 ℃, the dissolving rate of polysaccharides increases with temperature rise; when the temperature is higher than 45 ℃, the dissolving rate of polysaccharides drops; with increase in freezing-thawing times, the increase of dissolving rate of polysaccharides is slight when the freezing time exceeds 3 h; with increase in the freezing time, the dissolving rate of polysaccharides gradually increases, but when the freezing time exceeds 3 h, the dissolving rate of polysaccharides tends to become steady; when the freezing temperature drops, the dissolving rate of polysaccharides gradually rises, but when the temperature is lower than -42 ℃, the dissolving rate of polysaccharides tends to become steady. [Conclusion] The optimal process combination of repeated freezing and thawing method for extracting polysaccharides from Goji Berry is as follows: 45 ℃ for thawing temperature, 4 for repeated times; 3 h for freezing time; -28 ℃ for freezing temperature.

Goji Berry polysaccharides; Repeated freezing and thawing method; Dissolving rate; Extraction

辽宁省2014省级大学生创新创业训练项目(20141016-2000035)。

温梓辰(1996- )，男，湖南长沙人，本科生，专业：药学。*通讯作者，讲师，博士，从事食品质量与安全研究。

2016-05-26

S 567.1+9

A

0517-6611(2016)19-111-03