PARP抑制剂对Lewis肺癌细胞及移植瘤放疗增敏作用及其机制

王维 段碧霞 曾丽

电离辐射所致的肿瘤细胞DNA损伤主要为链断裂：单链断裂（single strand breaks,SSBs）与双链断裂（double strand breaks,DSBs）；其中SSBs发生的频率是DSBs的10倍-20倍[1]。在通常情况下，电离单击所致的SSBs多能通过细胞内聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-rbose)polymerase,PARP]、DNA连接酶以及其他损伤修复相关因子的参与进行较完整的修复[2]，而DSBs的修复则要困难很多，需通过激活同源重组（homologous recombination,HR）或非同源末端连接（nonhomologous end joining,NHEJ）途径完成[1,3]。DSBs成为电离辐射在细胞染色体上最致命的损伤，DNA损伤修复与否则是影响受照细胞存活的关键因素[1,4]。基于PARP在细胞SSBs修复中的关键性作用，靶向抑制其修复的新思路成为近年来研究的热点之一，相关新药Olaparib（PARP1/PARP2/PARP3抑制剂，奥拉帕尼）于2014年12月美国FDA批准上市。临床研究[5-7]结果表明，Olaparib联合紫杉醇、吉西他滨、铂类等化疗药物治疗可使得患者获益。目前，PARP抑制剂在联合放疗方面研究较少，已有的相关研究报告[8,9]显示，其在体外联合照射细胞可提高放疗生物效应。本实验在Lewis肺癌细胞及小鼠移植瘤模型上研究PARP抑制剂联合放疗时生物效应的变化，并探索其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株与实验小鼠 Lewis肺癌细胞株为本实验室保存。C57/BL小鼠：雌性，6周-8周龄，重15 g-20 g，饲养于无特定病原体（specific pathogen free,SPF）级环境，购于北京华阜康生物科技公司，实验动物许可证编号：SCXK(京)2014-0004。实验获本院动物保护和应用委员会批准，动物实验人员资格证书编号：CQLA-2013-0734。

1.1.2 主要试剂 MTT试剂盒购于北京康为世纪生物科技公司，Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购于Biosciences公司，Olaparib-AZD2281购于Selleck Chemicals公司，BCA蛋白浓度测定、Beyo ECL Plus发光试剂购于上海碧云天生物技术公司，Anti-Phospho-Histone H2AX(Ser139)购于Upstate公司，Bax、caspase-3、Bcl-2兔抗鼠单克隆抗体购于Abcam公司，TUNEL试剂盒购自美国罗氏公司。

1.2 细胞培养及移植瘤小鼠建模 Lewis肺癌细胞培养于DMEM/HIGHGLUCOSE培养基中（10%胎牛血清，100 μg/mL青霉素-链霉素），于37℃、5%CO2、90%湿度孵箱中培养，细胞贴壁。取对数期生长细胞，消化计数，约1.5×106个细胞/只接种于小鼠右侧肋部。

1.3 MTT检测Olaparib IC10浓度 Lewis细胞以8.0×103个/孔接种于96孔板，细胞贴壁，各孔加入Olaparib［浓度梯度（μmol/L）：0、3.125、6.25、12.5、25、50］，各浓度3个复孔。培养48 h后各孔中加入20 μL MTT，避光4 h弃上清，加入150 μL二甲基亚砜，避光振荡5 min。酶标仪测各孔吸光度（density,D）值（570 nm波长处）。存活率=（实验组各孔D值/空白组D值）×100%，通过BLISS法计算10%抑制浓度（10% inhibitory concentration,IC10）与50%抑制浓度（50% inhibitory concentration,IC50）值。IC10作为后续Olaparib体外用药浓度。

1.4 克隆形成实验比较 实验分为放疗（radiotherapy,RT）组与Olaparib+RT组，两组照射均含0 Gy、0.5 Gy、1 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy剂量点。均使用Synergy直线加速器6 MV X射线（剂量率：1 Gy/min）等中心照射，射野10 cm×15 cm，源皮距=100 cm，瓶面放一1.5 cm厚等效有机玻璃。取对数期细胞，根据不同照射剂量点以100个-10,000个细胞/孔（表1）接种于6孔板，待细胞贴壁后，用药组照射前2 h加入Olaparib后行相应剂量点照射。受照细胞培养10 d后，经固定、染色、晾干处理，采用光镜计数各剂量点集落数目（≥50个细胞为一集落）。接种效率=0 Gy点平均集落数/100，存活分数（survival fraction,SF）=该剂量点平均集落数/(该点接种细胞数×接种效率），根据经典单击多靶模型SF=1-[1-exp(-D/D0)]N拟合曲线，得到平均致死剂量D0值，放疗增敏比（sensitivity enhancement ratio,SER）=D0（RT组）/D0（Olaparib+RT组）。

1.5 流式细胞术检测体外细胞凋亡 实验分为空白对照、Olaparib、RT（2 Gy）、Olaparib+RT（2 Gy）组，细胞以3.5×105个/孔密度接种于6孔板上培养24 h（用药组照射前2 h加入Olaparib），接受2 Gy照射。培养24 h，消化、洗涤、离心收集细胞，加入200 μL缓冲液重悬，再加入5 μL Annexin V/FITC和10 μL碘化丙啶，避光孵育15 min后加入300 μL缓冲液待用。使用流式细胞仪分类计数。右上象限及右下象限分别代表晚期与早期凋亡细胞。

1.6 小鼠移植瘤外照射 小鼠移植瘤体积平均长至250 mm3后，随机分为4组（n=5）：空白对照、Olaparib、RT（2 Gy×5 d）、Olaparib+RT组，0.9%Nacl或Olaparib（用法用量依据预实验结果及已有研究资料[10]：50 mg/kg/d，灌胃，照射前30 min-60 min给药）。空白对照（0.9%Nacl,d1-d5）、Olaparib组（Olaparib,d1-d5）、RT组（移植瘤照射，2 Gy/d，d1-d5）、Olaparib+RT组（Olaparib，d1-d5；移植瘤照射，2 Gy/d，d1-d5）。每隔2天游标卡尺外部测量移植瘤最大径A及最小径B，瘤块体积V=π/6×[（A+B）/2]3，绘制肿瘤生长曲线，移植瘤长至4倍初体积（1,000 mm3）后处死小鼠。比较各组小鼠移植瘤长至4倍初体积（1,000 mm3）时所需天数。

1.7 Western blot检测γH2AX、Bax/Bcl-2、Caspase-3蛋白表达 收集目的细胞（2 Gy剂量点，受照后2 h）、瘤块组织（小鼠放疗结束后，即d6），RIPA裂解液裂解细胞（组织），调整样品蛋白浓度。8%SDS-PAGE分离样品蛋白60 μg，250 mA恒流电转膜至硝酸纤维滤膜，封闭2 h，置于一抗封闭液中，4℃孵育过夜。将膜置于含辣根过氧化物酶偶联的IgG二抗中，孵育2 h后采用ECL Plus发光试剂显色。以GAPDH为内参，采用Image Lab软件分析条带灰度值，以目的蛋白/GAPDH比值半定量反应蛋白相对表达水平。

1.8 TUNEL法检测瘤块细胞凋亡 采用凋亡细胞的原位末端转移酶标记法（TUNEL法），TdT酶液和荧光标记液按1:9比例混合，配成TUNEL反应液（整个操作步骤按说明书进行）。正常细胞核染为蓝色，凋亡细胞核染为棕黄色，在×400高倍视野（high power,HP）光学显微镜下随机选取5个癌区，计数凋亡细胞数（个/HP）。

1.9 统计学方法 使用IBM SPSS 19.0统计软件进行数据分析。数据以Mean±SD表示，两组数据间比较使用t检验，两组以上数据比较使用单因素方差分析（ANOVA）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

图1 多靶单击模型拟合细胞存活曲线Fig 1 Cell survival curves plotted by the “single-hit multi-target model”.RT：Radiotherapy.

2.1 Olaparib对Lewis细胞增殖抑制作用 MTT检测结果示，Lewis细胞在浓度梯度（μmol/L）为：0、3.125、6.25、12.5、25、50的Olaparib作用下存活百分比依次为：100%、97.33%、84.36%、59.67%、39.16%、24.56%，计算得出IC10与IC50值分别为：4.4 μmol/L、19.6 μmol/L。可见随Olaparib浓度增高，细胞存活率降低，即Olaparib体外对Lewis细胞存在剂量毒性，故选择低毒剂量IC10值作为Olaparib体外用药浓度。

2.2 细胞克隆形成情况 克隆形成实验得出，RT组与Olaparib+RT组细胞在0 Gy、0.5 Gy、1 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy各剂量点存活分数（表1）。多靶单击模型SF=1-[1-exp(-D/D0)]N拟合曲线（图1）得出放射生物学指标D0值（Gy）在RT组与Olaparib+RT组中分别为：0.797、0.658。Olaparib联合放疗SER为1.211（0.797/0.658）。

2.3 不同处理组细胞体外凋亡差异 细胞接受2 Gy照射后24 h，行流式细胞术检测细胞凋亡率（图2）。Olaparib+RT组、Olaparib组、RT组、空白组中Lewis细胞凋亡率依次为：（24.77±2.0）%、（3.89±1.1）%、（16.22±2.4）%、（0.53±0.1）%。可见Olaparib+RT组细胞凋亡率显著高于其余三组（均P＜0.05）。

2.4 不同处理组移植瘤细胞体内凋亡差异 光镜下（×400）Olaparib+RT组、Olaparib组、RT组、空白组移植瘤组织中TUNEL染色阳性（凋亡）细胞的细胞核呈棕黄色（图3），其平均凋亡细胞数（个/HP）依次为：（12.4±1.1）、（4.4±1.1）、（8.0±1.2）、（2.2±0.8）。统计得出，Olaparib+RT组细胞凋亡率显著高于其余三组（均P＜0.05）。

表1 各剂量点细胞存活分数Tab 1 Cell survival fraction at each dose point

图2 Lewis细胞体外凋亡率差异。流式细胞术检测各组细胞凋亡率，可见Olaparib+RT组细胞体外凋亡率显著高于其余三组（均P＜0.05）。Fig 2 Differential cell apoptotic rate in vitro.Cell apoptotic rate was measured by flow cytometry analysis.The apoptotic cells in Olaparib+RT group were significantly higher than the other three groups in vitro (all P＜0.05).

2.5 DNA损伤及凋亡相关蛋白表达差异 Lewis细胞在接受2 Gy照射后2 h与移植瘤照射（2 Gy×5 d）后1天，Western blot检测各处理组γH2AX（DNA双链断裂相关蛋白），促凋亡蛋白Bax、Caspase-3，抗凋亡蛋白Bcl-2表达。结果显示，Olaparib+RT组与RT组相比，γH2AX、Bax、Caspase-3蛋白在体外实验中分别上调60.5%、40.0%、42.0%，在移植瘤中分别上调71.4%、37.7%、31.3%；Bcl-2体外实验中下调45.2%，移植瘤中下调61.0%（图4）。

2.6 移植瘤生长曲线比较 各处理组小鼠用药及放疗过程中精神饮食状态正常，无明显全身性不良反应，各组移植瘤体积平缓长至250 mm3左右，开始相关实验。各组移植瘤增长过程中均有出现1个-2个移植瘤中央部破溃。10 Gy剂量照射结束后同时剥取未破溃瘤块行前述组织相关指标检测（图5A）。在Olaparib+RT组、Olaparib组、RT组、空白组中移植瘤增长至4倍初体积（1,000 mm3）所需时间（d）依次为：（29.6±3.8）、（11.6±2.6）、（21.2±2.3）、（10.8±1.1）（图5B）。可见，Olaparib+RT组移植瘤长至4倍初体积所需天数显著高于其余三组（均P＜0.05）。

图3 Lewis细胞体内凋亡率差异。TUNEL染色检测各组细胞凋亡情况（×400）。Olaparib+RT组细胞体内凋亡率显著高于其余三组（均P＜0.05）。Fig 3 Differential cell apoptotic rate in vivo.Cell apoptotic rate in xenograft tissues was observed by TUNEL stain (×400).The apoptotic cells in Olaparib+RT group were significantly higher than the other three groups in vivo (all P＜0.05).

图4 Lewis细胞体内外DNA损伤及凋亡相关蛋白表达。A：Lewis细胞体外照射（2 Gy）后；B：Lewis移植瘤照射结束（2 Gy×5 d）后，Western blot检测γH2AX、Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达。*P＜0.05，**P＜0.01相较于RT组。Fig 4 DNA damage and apoptosis related protein expression of Lewis cells in vitro and in vivo.The ralative protein levels of γH2AX,Bax/Bcl-2,Caspase-3 were measured by Western blot.A：After Lewis cells were irradiated in vitro (2 Gy)；B：After Lewis xenografts were irradiated (2 Gy×5 d ).*P＜0.05,**P＜0.01 vs RT group.

图5 荷瘤小鼠与移植瘤生长延缓曲线。A1：Lewis移植瘤照射（2 Gy×5 d）后剥取瘤块用于相关指标检测；A2：荷瘤小鼠（未破溃）；A3：荷瘤小鼠（瘤块中心破溃）；B：移植瘤增长至4倍初体积（1,000 mm3）生长延缓曲线。Fig 5 Tumor-bearing mice and Lewis xenografts growth delay curves.A1：Xenografts were isolated for detecting at the next day after irradiated (2 Gy×5 d)；A2：Tumor-bearing mice without xenograft rupture；A3：Tumor-bearing mice with xenograft rupture；B：Delay curves of Lewis xenografts increasing to quadruple size from the start.

3 讨论

根据经典的“单击多靶”模型，电离辐射可致肿瘤细胞内产生大量的SSBs，同样的，作用于DNA化学结构的细胞毒类药物也可使肿瘤细胞产生较多SSBs。多数的SSBs能通过PARP等相关因子修复，当PARP活性被靶向抑制后，大量外源性的SSBs存在于细胞内，当进入下一个复制叉后，SSBs可转变为DSBs[11]。修复DSB，必须通过激活HR或NHEJ信号通路来完成，若该通路中的关键分子（如BRCA1/2、ATM等）发生功能突变，即可对细胞产生所谓的“合成致死”效应，这就是Olaparib及其他PARP抑制剂在临床研究中单药或联合化疗治疗伴有BRCA1/2突变的恶性肿瘤的基础。

凋亡是肿瘤细胞受电离辐射后产生的主要生物效应之一，在线粒体介导的凋亡途径中，细胞在生存信号缺失、DNA严重受损（如DSB）、生长因子缺乏等情况下，可通过Bcl家族的促凋亡成员（如Bax等）与抗凋亡成员（如Bcl-2等）调控线粒体膜通透性，释放凋亡活性物质进入细胞质，引起Caspase级联反应，诱导细胞凋亡[12]。与正常组织细胞相比，DNA损伤修复通路在肿瘤细胞中过度激活，并且在机体接受放化疗时，对其有着负性调控作用[13]。本实验旨在研究Olaparib联合放疗时，是否可通过增加Lewis细胞DNA损伤及凋亡而起到放疗增敏作用。

本实验首先在体外细胞水平研究Olaparib联合放疗时的增敏效应。运用MTT技术检测Olaparib对Lewis细胞的增殖抑制作用，可见随药物浓度增加，抑制率上升，即Olaparib单药对Lewis细胞存在细胞毒作用，故选择低毒剂量IC10值作为体外联合放疗时的药物浓度。通过放射生物学研究常用的克隆形成实验，比较了单纯放疗与Olaparib联合放疗在Lewis细胞层面的生物效应差异，得出Olaparib联合放疗组D0值较RT组增加了21.1%，SER为1.211，证实了Olaparib体外的放疗增敏效应。为进一步探究其可能机制，检测不同处理组与受照细胞DSBs相关的敏感指标，即与DSBs量存在对应关系的磷酸化组蛋白H2AX（γH2AX），其被认为是检测DNA双链断裂的“金标准”。通过蛋白印迹相对定量得出，γH2AX在空白及单药Olaparib组中未表达，而在RT与Olaparib+RT组中高表达，且联合组γH2AX表达量较RT组增加约60%。可见，体外Lewis细胞在低剂量Olaparib联合放疗时即可显著增加DSBs形成。

实验进一步通过流式细胞术检测不同处理组细胞的凋亡率得出，Olaparib联合放疗组较单放疗组细胞凋亡率显著提高。研究[14-16]表明，Bax与Bcl-2蛋白可形成异源二聚体抑制凋亡，Bax间可形成同源二聚体促进凋亡，即在Bax/Bcl-2途径中Bax促进凋亡而Bcl-2抑制凋亡，并进一步通过细胞色素C及Caspase-9等因子激活下游Caspase-3蛋白，最终诱导细胞凋亡。本研究对这些凋亡相关蛋白检测发现，Lewis细胞在接受2 Gy照射后，Olaparib联合放疗组促凋亡蛋白Bax及Caspase-3较单纯放疗显著增加，抗凋亡蛋白Bcl-2显著下降。Wesierska等[17]研究PARP-1抑制剂AZD2261发现，其可显著抑制乳腺癌MCF-7与Skbr-3细胞克隆形成，并通过Caspase-3蛋白的激活诱导细胞凋亡。在本实验中，Olaparib单药组对Lewis细胞凋亡影响较小（约3.89%），考虑与用药浓度较低相关（IC10值浓度）。Tuli等[18]研究PARP1/2抑制剂ABT-888联合放疗胰腺癌MiaPaCa-2细胞时发现，ABT-888单药（10 μmol/L）时对MiaPaCa-2细胞凋亡相关蛋白Caspase表达影响小，而当联合放疗时可显著提高促凋亡蛋白表达。这与本研究结果相一致。

在Lewis细胞移植瘤模型实验中，Olaparib单药给予5 d较空白对照组并未引起明显的肿瘤生长延缓，而当联合放疗（2 Gy×5 d）后，观察到移植瘤显著的生长延缓效应，与单纯放疗组相比，其增长至4倍初体积所需天数多出近10 d。同体外研究类似，实验检测了受照射后移植瘤组织中凋亡细胞、DNA损伤及凋亡相关蛋白的表达情况，获得了与体外研究一致的结果，即联合组较单纯放疗组移植瘤组织中凋亡细胞更多，DSBs相关γH2AX、促凋亡蛋白Bax与Caspase-3表达更高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，进一步验证了体内外Olaparib联合放疗时的增敏效应。

综上所述，本研究通过Lewis肺癌细胞及移植瘤模型证实了Olaparib的放疗增敏效应，其可通过增加受照Lewis细胞的DSBs形成，上调Bax/Bcl-2促凋亡体系蛋白表达而提高照射生物效应。为PARP抑制剂在联合放疗方面的应用提供了实验依据，为临床肺癌放疗提供一个新的优良的放疗增敏剂，值得进一步的体内及临床研究。