系统性鉴定长非编码RNA MALAT1调控的微小RNA

张海天 王国祥 尹荣 邱满堂 许林

长非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）广泛参与了各种生理和疾病过程，在肺癌的发生和进展过程中也发挥着重要的调控作用[1,2]。MALAT1是肺癌中最早被鉴定的lncRNA之一，也是肺癌研究领域中研究最多的lncRNA之一，很多研究都证实MALAT1可以促进肺癌的恶性进展[3-5]。

MALAT1在肺癌中的分子机制目前已有相关报道，但是对MALAT1与微小RNA（microRNA, miRNA）的相互调控关系的研究尚少[6,7]。此外目前关于MALAT1与miRNA的研究多是集中在miRNA对MALAT1表达的负性调控[7]，而MALAT1对miRNA表达的调控作用尚未见系统性研究。因此，本研究旨在通过实验和生物信息手段，系统性地研究MALAT1调控的miRNA。

1 材料与方法

1.1 实验材料 A549细胞购买于中国科学院上海细胞库，H1640培养基购于南京凯基公司，RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒和实时定量PCR试剂盒购于Takara公司，TaqMan Low Density Array（TLDA）芯片购于AppliedBiosystems公司，转染试剂Lipo2000购于Invitrogen公司。实验所用引物和反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides,ASO）于南京金斯瑞公司合成，MAL AT1引物序列：上游5’-GGATCCTAGACCAGCATGCC-3’，下游5’-AAAGGTTACCATAAGTAAGTTCCAGAAAA-3’；β-肌动蛋白引物序列上游：5’-GAAATCGTGCGTGACATTAA-3’，下游：5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’。ASO序列：ASO1：5’-ATGGAGGTATGACATATAAT-3’，ASO2：5’-TCTTATGTTTCCGAACCGTT-3’[3,4]。

1.2 细胞培养与转染 A549细胞培养在10%FBS的H1640培养基中，37 ℃、5%CO2饱和湿度培养。将A549细胞接种于六孔板中转染，使用Lipo2000试剂以终浓度100 nmol/L转染ASO[4,8]。RT-PCR法检测MALAT1表达：A549细胞转染24 h后使用Trizol法提取总RNA，根据试剂盒说明进行逆转录反应。RT-PCR反应体系：cDNA 0.5 μL、水3.7 μL、上下游引物各0.4 μL、2×reaction mix 5 μL，使用ABI 7900仪器进行RT-PCR反应，每组实验均以β-actin作为内参[9,10]。

1.3 TaqMan Low Density Array（TLDA）实验 A549细胞转染后提取总RNA并逆转录，使用ABI 7900仪器根据制造商说明书进行TLDA芯实验，使用制造商提供的RQ manage软件进行数据分析。

1.4 基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA） 将差异表达基因按照差异倍数从高到低排序，使用GSEA软件中的GseaPreranked选项进行数据分析，miRNA基因集注释文件下载自GSEA网站[11]。

1.5 统计学方法 采用SPSS 18.0软件完成统计分析。使用Student’st检验计算MALAT1表达差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 在A549细胞中敲减MALAT1 在A549细胞中转染诊断MALAT1的ASO序列和阴性对照序列（scramble），与对照组相比，转染ASO1和ASO2后MALAT1表达被下调，且ASO1效果更佳（图1A）。

2.2 TLDA实验 使用ASO1在A549细胞中敲减MALAT1，通过TLDA实验检测miRNA表达变化，以P＜0.05为筛选标准，共发现131个上调、22个下调的miRNA。

2.3 GSEA分析 GutschnerT在A549细胞中敲减MALAT1后通过基因表达谱芯片发现458个差异表达基因[3]，本研究对这些差异表达基因进行GSEA分析，发现有多个miRNA在这些差异表达基因中被显著富集。

2.4 MALAT1调控的miRNA 将TLDA得到的差异表达miRNA和GSEA富集的miRNA取交集，获得45个miRNA，进一步筛选表达与调控关系相符的miRNA，最终获得28个被MALAT1调控的miRNA（表1，图1B）。根据MALAT1与这些miRNA的表达关系，我们构建了MALAT1-miRNA调控网络（图1C）。

3 讨论

MALAT1是2004年Ji等[12]发现的、一个长8,556核苷酸的反义lncRNA，MALAT1位于11号染色体。MALAT1在肺癌组织中显著高表达，且MALAT1高表达提示患者预后不良[13]，同时体内和体外实验都证实MALAT1可以促进肺癌细胞侵袭和增殖能力[1,14]。在食管癌、胃癌、肝癌等其他肿瘤中，MALAT1也发挥着促癌基因作用[15-17]。

图1 相对于阴性对照序列（scramble），ASO1和ASO2抑制了MALAT1表达水平，ASO1下调作用更佳，*P＜0.05（A）；28个miRNA在TLDA芯片中表达水平，红色表达上调，绿色表达下调（B）；MALAT1和miRNA调控网络，蓝色：MALAT1，绿色：敲减MALAT1后表达上调miRNA，红色：敲减MALAT1后表达下调的miRNA（C）。Fig 1 ASO1 and ASO2 significantly inhibited MALAT1 expression level, compared with scramble sequence, and ASO1 showed better inhibitory effect. *P＜0.05 (A). Expression level of the 28 miRNAs in TLDA results, red: up-regulation, green: down-regulation (B); regulatory network of MALAT1 and miRNAs; blue: MALAT1, green: miRNAs up-regulated after MALAT1 knockdown, red: miRNAs down-regualted after MALAT1 knockdown.

关于MALAT1的分子生物学机制已有较多研究，但是对于MALAT1调控miRNA方面研究较少。本研究首先设计并合成了特异性靶向MALAT1的ASO，并有效的敲减了MALAT1的表达。通过TLDA芯片，发现敲减MALAT1之后很多miRNA表达发生显著变化，证实MALAT1会影响miRNA表达，提示miRNA可能通过调控miRNA表达来发挥生物学功能。Gutschner等[3]通过ZFN技术敲减了MALAT1，并发现了458个差异表达基因，我们使用GSEA方法分析了这些差异表达基因，寻找这些基因中被富集的miRNA结合位点。GSEA可以分析一个预先定义的基因集是否被富集[9]。敲减MALAT1后miRNA表达下调，则miRNA靶基因表达上调；对差异表达基因GSEA分析，miRNA会被正性富集。因此，在对TLDA和GSEA取交集的45个miRNA中进一步筛选出下调-正性富集和上调-负性富集的28miRNA，即这28个miRNA是被MALAT1调控的miRNA。

Tripathi等[4]首先报道MALAT1可以影响RNA剪切，而后Gutschner等[3]通过芯片分析发现MALAT1敲减之后对RNA剪切影响不大，而对基因表达水平有重要影响，提示MALAT1可以调控基因转录。之后，诸多研究[17,18]发现MALAT1可以通过与RNA结合蛋白绑定调控下游基因的转录。因此MALTA1也可能通过与RNA结合蛋白绑定直接调控miRNA转录；此外，受MALAT1调控的基因也可能间接调控miRNA表达。然而，对于本研究鉴定出的28个miRNA，还需进一步实验来明确MALAT1具体是通过何种机制调控这些miRNA的表达。

表1 28个MALAT1调控的miRNATab 1 28 miRNAs regulated by MALAT1

本研究通过实验和生物信息学分析手段、系统性地研究了MALTAT1调控的miRNA，为进一步研究MALAT1和miRNA的调控网络提供了参考。