长期单施化肥和有机无机配合条件下红壤蔗区土壤生物学性状及细菌多样性差异

杨尚东, 李荣坦， 谭宏伟， 周柳强， 谢如林, 黄金生

(1 广西大学农学院, 南宁 530004； 2 广西农业科学院甘蔗研究所，广西甘蔗遗传改良重点实验室， 南宁 530007；3 广西农业科学院农业资源与环境研究所， 南宁 530007)



长期单施化肥和有机无机配合条件下红壤蔗区土壤生物学性状及细菌多样性差异

杨尚东1，2, 李荣坦1， 谭宏伟2*， 周柳强3， 谢如林3, 黄金生3

(1 广西大学农学院, 南宁 530004； 2 广西农业科学院甘蔗研究所，广西甘蔗遗传改良重点实验室， 南宁 530007；3 广西农业科学院农业资源与环境研究所， 南宁 530007)

【目的】分析红壤区长期施肥的蔗区土壤生物学性状和细菌多样性，旨在提出提升红壤蔗区土壤肥力与健康的施肥方案。【方法】试验从1995年开始，于广西来宾市蒙村镇那洪村甘蔗长期试验站进行。试验设置不施肥(CK)、 长期单一施用化肥(NPK)和长期化肥配施有机肥(NPKM)3个处理。采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)以及稀释平板法等传统和现代分析技术，比较分析了3种长期不同施肥处理对蔗区土壤生物学指标、 细菌多样性等指示土壤肥力与健康状况指标的影响。【结果】施肥处理导致甘蔗产区土壤pH下降，NPK处理下降幅度大于NPKM处理。土壤中可培养微生物数量(细菌、 真菌和放线菌)均以NPKM处理为最高，NPK处理真菌数量显著高于CK，放线菌数量却显著低于CK土壤，细菌数量两者间无显著差异。微生物量碳、 氮以及涉及碳、 氮、 磷循环的土壤酶活性均以NPKM处理土壤为最高，与NPK和CK土壤差异显著。NPK处理土壤中β-葡糖苷酶活性以及微生物量碳高于CK土壤，但蛋白酶、 磷酸酶活性以及微生物量氮显著低于CK土壤。NPKM处理土壤中细菌多样性指数(H)、 丰富度(S)以及均匀度(EH)指数等同样表征土壤肥力与质量的敏感指标均高于NPK和CK土壤。【结论】长期施肥可不同程度地导致红壤蔗区土壤pH下降，长期单一施用化肥处理下降幅度高于化肥与有机肥配施处理。长期单一施用化肥加剧了土壤肥力下降与质量劣化，化肥配施有机肥是减缓红壤甘蔗产区土壤pH下降、 提升土壤肥力和保持土壤健康的有效措施。

红壤； 甘蔗； 长期施肥； 生物学性状； 细菌多样性

红壤,包括红壤、 赤红壤和砖红壤,是广西主要的土壤类型，面积达1074万公顷，占广西土地总面积的65.55%[1]。广西红壤是广西农业综合开发和林业发展的重要基地，亦是农业生产强度高和实现广西农业高产出的地区之一[2-3]。广西甘蔗的栽培面积及蔗糖产量位居全国首位。2012/2013榨季，广西甘蔗的种植面积达1080千公顷，甘蔗产量达7500.0万吨，产糖791.5万吨，占全国食糖总产的60.57%[4]。但过去相当长的一段时期里生产者以追求产量为主要目标，长期盲目地以化肥为主要肥源，缺乏维护蔗区土壤肥力意识。长期单一的化肥施用已导致蔗区土壤pH和肥力下降，甘蔗总产与产糖量从2008/2009榨季开始至2011/2012榨季连续3年下降[4]。究其原因，除了种植面积稍减之外，蔗区土壤肥力下降及土壤健康劣化亦是导致甘蔗产量下滑的另一个主要原因[5]。

1　材料与方法

1.1试验区概况

1.2试验设计

长期定位施肥试验始于1995年。试验设不施肥对照(CK)、 单施氮磷钾化肥(NPK)、 氮磷钾化肥加有机肥(NPKM)3个处理，试验小区面积33.3 m2。供试化肥为尿素(N 46%)、 过磷酸钙(P2O512.5%)和氯化钾(K20 60%)，有机肥用农家堆沤粪肥(平均含N 7.1%、 P2O52.5%、 K2O 5.6%，其中有机氮占总氮的70%)。施肥处理不考虑有机肥中的氮、 磷、 钾投入。化肥施用量为尿素600 kg/hm2、 过磷酸钙90 kg/hm2、 氯化钾225 kg/hm2， 有机肥4500 kg/hm2，所有肥料的10%作基肥，90%分2次追肥。

1.3样品采集与制备

土壤样品于甘蔗收获后采集，2000年后每隔2年以相同取样方法采集一次，本文采用2014年采集的样品进行了对比分析。 每个处理小区按“之”字形用土钻随机采取0—30 cm的5点土壤样品，混合均匀后平均分成2份。一份过2 mm筛后置于4℃保存，用于土壤生物学性状及细菌群落结构的分析。另一份室内自然风干后过0.5 mm筛，用于土壤理化性状的分析。

1.4分析方法

1.4.1 土壤微生物活性测定土壤微生物数量采用稀释平板法[14]； 微生物生物量碳、 氮采用氯仿熏蒸提取法[15-16]； β-葡糖苷酶(β-Glucosidase)活性采用Hayano法[17]，以硝基苯-β-D-葡糖苷为基质； 蛋白酶(protease)活性采用Ladd法[18]，以白明胶为基质； 磷酸酶(phosphatase)活性采用Tabatabai和Bremner的方法[19]，以p-硝基苯磷酸钠为基质。

1.4.2 土壤细菌群落结构土壤基因组总DNA的提取，参照Krsek和Welington的方法[20]并稍加修改进行。称取5 g土壤，采用提取液和回收试剂盒(biospin gel extraction kit，Bioflux)进行基因组总DNA的提取和纯化，粗提和纯化结果采用1.0%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测； 纯化后样品于-20℃冰箱保存备用。

土壤细菌16S rDNA V3可变区的PCR扩增，采用对大多数细菌的16S rRNA基因V3区具有特异性的引物对F338GC和R518[21-23]，它们的序列(上游引物)分别为F338GC5′-(CGCCCGCCGCG CGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCT ACGGGAGGCAGCAG-3′)； 下游引物为R518(5′-AT-TACCGCGGCTGCTGG-3′)，PCR产物用1.5%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5数据处理

采用Quantity One分析软件(Bio-Rad)对各土壤样品的电泳条带数目及密度进行定量分析。多样性指数(Shannon-Wiener index，H)、 丰富度(S)和均匀度(EH)的计算参照罗海峰等[24]的方法进行。数据处理采用Excel 2003进行。

2　结果与分析

2.1长期不同施肥处理对蔗区土壤理化性状的影响

基础土样和试验18年后土壤理化性质见表1。与试验前相比，人为干扰(施肥与种植)均不同程度地导致土壤pH下降。其中，以NPK处理土壤的下降幅度最大，不仅与试验前相比呈显著差异，而且与其他处理相比亦有显著差异。NPKM处理与试验前相比，土壤pH虽然也呈下降趋势，但下降幅度显著低于NPK处理，且在有机质含量、 全氮含量以及速效磷等部分理化性状指标上亦显著优于NPK处理。这一结果表明长期化肥配施有机肥有助于减缓土壤pH下降，提高土壤肥力。

表1　不同施肥处理试验前后土壤理化性状

2.2长期不同施肥处理对蔗区土壤可培养微生物数量的影响

由表2可知，NPKM处理土壤中可培养细菌数量不仅显著高于CK，而且显著高于NPK处理，但NPK处理和CK处理之间可培养细菌数量无显著差异。另一方面，NPKM处理的可培养真菌数量亦显著高于CK处理，但与NPK处理之间无显著差异； 可培养放线菌数量亦是NPKM处理为最高，其次为CK处理，NPK处理最低，而且NPKM处理与CK处理和NPK处理之间均呈显著差异。产生上述现象的原因是由于化肥配施有机肥增加了土壤有机质含量(表1)，进而显著提高了土壤中可培养微生物的数量，而单一的NPK处理不利于提高土壤有机质含量。

表2　不同施肥处理18年后土壤可培养微生物数量 (cfu/g, dry soil)

注(Note): CK—空白土壤 No any fertilizer input； NPK—单施氮磷钾化肥 Chemical fertilizer only； NPKM—化肥加有机肥Chemical and organic fertilizer combination; 数值后不同小写字母表示处理间在0.05水平上差异显著 Values followed by different letters are significant among treatments at the 0.05 level.

2.3长期不同施肥处理对蔗区土壤酶活性的影响

β-葡糖苷酶活性可表征土壤碳素循环速度。三个处理土壤中β-葡糖苷酶活性大小为NPKM>NPK>CK，且NPKM处理显著高于NPK和CK，表明化肥配施有机肥的土壤中碳素循环快，有助于提高和维持土壤肥力。

土壤磷酸酶活性高低直接影响着土壤有机磷的分解转化及其生物有效性。土壤磷酸酶包括酸性磷酸酶、 中性磷酸酶和碱性磷酸酶[25]。本试验供试土壤pH均在6以下，所以仅测定其中的酸性磷酸酶。蛋白酶参与土壤中蛋白质以及其他含氮有机化合物的转化反应，其水解产物是植物吸收氮的来源之一[26]。从图1可以看出，各处理土壤中酸性磷酸酶及蛋白酶活性大小均为NPKM>CK>NPK，NPKM处理显著高于CK和NPK处理，NPK显著低于CK。显示化肥配施有机肥提高了土壤中氮、 磷的转化和供应能力，而长期单施化肥却降低了这一能力。

图1　长期不同施肥处理对土壤酶活性的影响Fig.1　Soil enzyme activities affected by long-term fertilizations[注(Note): CK—空白土壤 No any fertilizer input； NPK—单施氮磷钾化肥 Chemical fertilizer only； NPKM—化肥加有机肥Chemical and organic fertilizer combination; 柱上不同小、 大写字母分别表示处理间在0.05和0.01水平上差异显著 Different small and capital letters are significantly different among treatments at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.]

2.4长期不同施肥处理对蔗区土壤微生物生物量的影响

土壤微生物生物量是植物矿质养分的源和汇，是稳定态养分转变为有效态养分的催化剂[27]。由表3可知，土壤中微生物量碳(MBC)高低为NPKM>NPK>CK，三个处理间差异显著； 微生物量氮(MBN)高低为NPKM>CK>NPK，NPKM处理与CK和NPK处理差异显著，CK与NPK处理间差异不显著。这一结果与上述土壤酶活性类似，表明化肥配施有机肥对提升和维持红壤蔗区土壤肥力的效果显著优于单施化肥处理。

表3　长期不同施肥处理蔗区土壤微生物量碳、 氮含量(mg/kg)

注(Note): CK—空白土壤 No any fertilizer input； NPK—单施氮磷钾化肥 Chemical fertilizer only； NPKM—化肥加有机肥 Chemical and organic fertilizer combination.数值后不同小写字母表示处理间在0.05水平上差异显著 Values followed by different letters are significant among treatments at the 0.05 level.

2.5长期不同施肥处理对蔗区土壤细菌多样性的影响

2.5.1 土壤细菌群落DGGE图谱分析应用DGGE技术分离16S rRNA V3片段PCR产物，可分离到数目不等、 位置各异的电泳条带(图2)。根据DGGE能分离长度相同而序列不同DNA的原理，每一个条带大致与群落中的1个优势菌群或操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)相对应，条带数越多，说明生物多样性越丰富； 条带染色后的荧光强度越亮，表示该种属的数量越多[20]。土壤中细菌DGGE图谱的条带数量NPKM为31条，NPK为21条，CK为18条，NPKM处理的土壤细菌丰富度极显著高于NPK和空白对照，NPK处理与空白差异不显著。这一结果表明长期单一化肥处理对土壤细菌丰富度影响甚微，其原因可能与单一化肥处理没有增加土壤有机质含量有关(表1)

图2　长期不同施肥处理土壤细菌的DGGE图谱和树形聚类分析Fig.2　DGGE Profile and tree clustering analysis of soil bacteria collected from soils under different treatments

对土壤细菌多样性进行相似性分析(图2)，空白土壤和单一化肥处理之间土壤细菌的相似度较高，达82%； 化肥配施有机肥处理与化肥及空白土壤间土壤细菌的相似性系数低于60%，仅为57%。一般认为，相似性系数高于60%的两个群体才具有较好的相似性[28]。试验结果说明长期单一化肥处理与有机肥处理对土壤细菌群落结构影响差异显著，而且长期单一化肥对土壤细菌群落结构的影响与空白处理无显著差异，这一现象可能与单一的化肥处理无益于增加土壤中的有机质含量有关。

2.5.2 土壤细菌多样性分析根据细菌16S rDNA的PCR-DGGE图谱中条带的位置和亮度的数值化结果计算了细菌群落结构指标Shannon-Wiener指数，Shannon-Wiener指数值越大，表明细菌群落多样性越高[29]。分析不同施肥处理土壤细菌Shannon-Wiener指数和均匀度指数(表4)。长期定位不同施肥处理土壤细菌多样性指数的大小顺序为NPKM(3.20)>NPK(2.45)>CK(2.31)，显示有机无机肥配合处理有助于提高蔗区土壤细菌多样性，长期单一化肥处理与空白相比，效果甚微，无助于提高土壤肥力，甚至在一定程度上导致土壤肥力下降及土壤健康的劣化。

均匀度是表示物种在环境中的分布状况，各物种数目越接近，数值越高[30]。同样由表4可知，3种施肥处理土壤中细菌均匀度指数以化肥配施有机肥为最高，而单一化肥处理和空白土壤之间土壤细菌均匀度指数并无大的差异。表明化肥配施有机肥处理对土壤细菌种群的分布以及菌群种类的影响效果显著优于单一的化肥处理。

表4　长期不同施肥处理土壤细菌种群多样性丰富度和均匀度指数

3　讨论

土壤微生物数量受土壤温度、 湿度、 通气状况、 耕作制度、 有机质含量及作物种类等因素的影响[31]。本研究中的土壤样品采自相同蔗区，气候条件一致，耕作管理一致，作物种类均为相同品种的甘蔗，因此土壤有机质含量应成为影响蔗区土壤微生物数量的主要影响因子。土壤中的有机物越多，土壤肥力越高，其中的微生物也就越多[32]。本文的分析结果显示，化肥配施有机肥处理极显著地提高了蔗区土壤中可培养微生物数量，其原因就是化肥配施有机肥提高了土壤有机质的含量，进而提高了蔗区土壤中可培养微生物的数量。

土壤酶主要来源于土壤微生物和根系分泌物。土壤中有机质的分解转化，依赖于微生物所产生的酶具有的催化活性来推动，同时亦是指示土壤肥力变化的敏感指标[33]。化肥配施有机肥的土壤，无论涉及碳素循环的β-葡糖苷酶、 或涉及土壤磷循环的磷酸酶以及涉及氮循环的蛋白酶活性均较高，而单一施用化肥土壤除β-葡糖苷酶外，磷酸酶和蛋白酶活性甚至还低于空白土壤(图1)，在一定程度上，表明单施化肥不利于土壤中氮、 磷循环的生物活动，导致土壤肥力降低，需要化肥与有机肥配合施用，才能达到既提高甘蔗的产量，又提高土壤肥力与维护土壤健康的作用。

4　结论

长期人为施肥均不同程度地导致红壤蔗区土壤pH下降，单一施用化肥下降幅度最明显。长期单施化肥会导致土壤微生物数量和涉及土壤碳、 氮、 磷循环的相关酶活性降低，表现为土壤微生物生物量碳、 氮量和细菌多样性降低，土壤肥力下降和质量劣化。化肥配施有机肥可有效减缓单施化肥造成的土壤pH下降，保持土壤微生物多样性和菌群数量，从而提升土壤肥力和保持土壤健康。

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Differences of soil biological characteristics and bacterial diversity of sugarcane fields in red soil region affected by long-term single chemical fertilization and chemical organic combined application

YANG Shang-dong1,2, LI Rong-tan1, TAN Hong-wei2*, ZHOU Liu-qiang3, XIE Ru-lin3, HUANG Jin-sheng3

(1CollegeofAgronomy,GuangxiUniversity,Nanning530004,China； 2GuangxiKeyLaboratoryofSugarcaneGeneticImprovement/GuangxiAcademyofAgriculturalSciences,Nanning530007,China, 3AgriculturalResourceandEnvironmentResearchInstitute,GuangxiAcademyofAgriculturalSciences,Nanning530007,China)

【Objectives】 Study on the soil biological characteristics and bacterial diversity of soils affected by long-term fertilization will provide support for the sustainable development of sugarcane industry in Guangxi Province, 【Methods】 Long-term experiment started since 1995 in Laibin county, Guangxi Province. Three treatments include no fertilization (CK), chemical fertilizer only (NPK) and chemical fertilizer plus organic fertilizer (NPKM). Soil microorganisms were analyzed by using PCR-DGGE and dilution plate methods. 【Results】 The soil pH shows decreasing in the three treatments, particularly in the NPK treatment. The numbers of bacteria, fungi and actinomycetes were the highest in the NPKM treatment, which were significant higher than in the NPK and CK treatments. The number of cultivable actinomycetes in NPK treatment was significantly lower than in the CK, and there was no significant difference in numbers of bacteria and fungi between the NPK and CK. The activities of soil β-Glucosidase, phosphatase and protease were the highest in the NPKM treatment, and its biomass C and biomass N showed the highest as well. The activities of protease and phosphatase, and the biomass N in the NPK treatment were all lower than in CK. The bacterial diversity index, richness and evenness were all higher in the NPKM treatment. 【Conclusions】 The soil pH is easily declined by the input of fertilizers, particularly under the long-term single chemical fertilizer use. The long-term chemical fertilization may also result in low biodiversity and low activities of nutrient supply related enzymes in soil, leading to soil fertility decline and soil degradation. Conversely, the long-term combination use of chemical fertilizer and manure is effective in slowing the soil pH decline, improving soil fertility and ecological quality in sugarcane fields of red soil regions in Guangxi Province, China.

red soil; sugarcane; long-term fertilization; biological characteristic; bacterial diversity

2015-12-12接受日期: 2016-02-22

IPNI项目； 广西农业科学院广西甘蔗遗传改良重点实验室开放课题(12-K-05-02)； 自治区重点项目(桂科基11199001)资助。

杨尚东(1970—)， 男， 广西南宁人， 博士， 副教授, 主要从事植物营养与调控、 土壤生态学方向的研究。

Tel: 0771-3235612, E-mail: ysd706@gxu.edu.cn。*通信作者 Tel: 0771-3899558, E-mail: hongwei_tan@163.com

S157.4; S154.1; S154.38+1

A

1008-505X(2016)04-1024-07