猪伪狂犬病毒感染病例的荧光定量PCR检测

2016-08-23贺志昊马惠琴龙冬梅王芸华杨廷军贵州省毕节市动物疫病预防控制中心贵州毕节551700

甘肃农业 2016年14期

贺志昊，马惠琴，龙冬梅，王芸华，杨廷军，张　平（贵州省毕节市动物疫病预防控制中心，贵州　毕节　551700）

贺志昊，马惠琴，龙冬梅，王芸华，杨廷军，张平
（贵州省毕节市动物疫病预防控制中心，贵州毕节551700）

毕节某猪场出现妊娠母猪流产、产死胎及部分仔猪发病的情况，为确诊病原，对流产胎儿的组织进行了实验室检测。流产胎儿的组织经猪伪狂犬病毒野毒株实时荧光PCR检测，结果显示，胎儿组织为猪伪狂犬病毒（PRV）阳性；根据临床症状及伪狂犬病毒野毒株实时荧光PCR检测确诊该猪场存在猪伪狂犬病毒野毒感染。

猪伪狂犬病毒；临床症状；实时荧光RT-PCR

猪伪狂犬病属于疱疹病毒科（Herpesviridae）、猪疱疹病毒属，是由疱疹病毒I型引起的一种急性传染病。可导致怀孕母猪发生流产、死亡、产木乃伊胎及弱仔；新生仔猪发生大批急性死亡，伴有呕吐、腹泻及发抖，震颤和运动失调等神经症状［1，2］；免疫抑制猪只对其它疫病易感性增加，影响仔猪生长发育。猪发生经典伪狂犬病后，其临诊症状因日龄而异。成年猪一般呈隐性感染；对怀孕母猪可导致出现流产，产死胎、木乃伊胎和种猪不育等综合症候群；15日龄以内仔猪的发病死亡率可达100%；目前猪群伪狂犬野毒感染率仍呈不断上升趋势，临床发病症状有所缓和，亚临床感染较多，防控形势依然十分严峻［3-5］。对毕节某规模猪场出现的妊娠母猪流产、产死胎及部分仔猪发病的情况，为确诊病原，本文利用实验室实时荧光RT-PCR诊断技术，最终确诊为猪伪狂犬病毒感染引起。

一、材料与方法

（一）材料

1.病料。采集流产胎儿组织放在50%甘油生理盐水溶液中，低温冷藏保存运至毕节市动物疫病预防控制中心兽医实验室。

2.主要试剂。世纪元亨猪伪狂犬病毒提取试剂盒，猪伪狂犬病毒通用型荧光定量PCR试剂盒

（二）方法

1.样品的处理：取流产胎儿组织，用手术剪剪碎混匀后取0.5g于组织匀浆机中研磨，加入2mL去离子水，研磨均匀后离心取500μL上清液于灭菌离心管中。

2.DNA提取：按照猪伪狂犬病毒提取试剂盒说明书进行。

3.实时荧光RP-PCR检测

反应采用25μL体系，反应体系为：无菌无核酸水2.7μL，RT-PCR反应液10μL，酶混合液0.4μL，荧光探针1.9μL，DNA模板10μL。反应条件为：45℃15min，95℃1min；95℃5s，60℃35s，在每个循环第二步收集FAM荧光信号，共40循环（报告基因“FAM”，淬灭基团“NONE”）

二、试验结果

（一）临床症状

仔猪：仔猪高热41℃以上、食欲废绝、呼吸困难、流涎、腹泻等症状，继而表现神经症状，被毛震颤，继肌肉痉挛、间歇性抽搐、共济失调、四肢呈划水状（见图1），后期麻痹、卧地不起以至昏迷死亡。怀孕母猪：出现流产、死胎、木乃伊胎和不育综合症候群，其中以产死胎为主。有轻微的咳嗽，渴欲增加，体温略有升高。

图1　病猪呈现抽搐，四肢呈现划水状

（二）实时荧光RT-PCR试验结果

对流产胎儿组织总DNA进行实时荧光RT-PCR检测，结果显示，组织样品为阳性（见图2）。

图2　PRV实时荧光RT-PCR检测结果A1：阳性对照；B1：阴性对照；C1/D1/H1：待检样品

由图2可知流产胎儿组织样品DNA均呈出现特异性扩及增曲线。现

三、讨论

目前疫苗免疫接种是预防和控制猪伪狂犬病的根本措施。该病目前尚无特效的治疗方法，主要通过血清免疫进行治疗。据报道对1月龄以内的仔猪，在感染后12 h腹腔注射抗病血清有治疗效果。对体重约20 kg的猪用30 m L含500个中和单位的抗血清治疗效果较好，可降低死亡率［6-8］。在病猪未出现神经症状之前，注射抗伪狂犬病高免血清或病愈猪的全血有一定疗效，如已出现神经症状则效果不明显。科学的疫苗免疫方案配合抗体检测验证免疫效果，采取严格的生物安全措施，消灭猪场的鼠类，坚持自繁自养，无害化处理对预防本病有重要意义。同时，还要严格控制犬、猫、鸟类和其他禽类进入猪场，严格控制人员来往，并做好消毒及定期监测等工作，如发现野毒感染血清学阳性猪应及时隔离或淘汰处理，以保持猪群无野毒感染和安全健康。

猪伪狂犬病一直是发病率、死亡率都很高的传染病，一旦发生会给养猪业带来很大损失，因此猪伪狂犬病的预防、诊断检测问题一直备受世界各国关注［9］。猪伪狂犬临床上多表为母猪的流产和仔猪的腹泻、神经症状，仅从临床表现和剖检很难将其与有相似症状的猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征等区分开来，需要进行实验室检测才能确诊。本文采用分子生物学技术对流产胎儿组织进行实时荧光RT-PCR方法的检测，确诊了该次疫病由猪伪狂犬病毒引起。为今后实验室确诊猪伪狂犬病提供基础科学依据。

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（编辑：刘国华）

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