冬虫夏草菌粉对肾缺血-再灌注损伤大鼠Klotho基因和免疫调节的影响*

2016-08-19李莉杨敏何华琼张秋芳吴胜英湖北医药学院机能实验室湖北十堰442000

中国中医急症 2016年7期

李莉杨敏何华琼张秋芳吴胜英（湖北医药学院机能实验室，湖北十堰442000）

·证治探讨·

李莉杨敏何华琼张秋芳吴胜英△
（湖北医药学院机能实验室，湖北十堰442000）

目的观察冬虫夏草菌粉对大鼠肾缺血-再灌注损伤动物模型Klotho基因和免疫调节的影响，探讨其可能的机制。方法30只Wistar大鼠分为假手术组、模型组、实验组。模型组和实验组大鼠采用夹闭双肾动脉45min后复灌方法造模，假手术组不夹闭双肾动脉作为对照。术后实验组给予10%冬虫夏草菌粉按2.0mL/（kg·d）灌胃，假手术组和模型组则给予2.0mL/（kg·d）生理盐水。灌胃治疗7 d后，检测尿磷（UP）含量、血清总蛋白（STP）、白蛋白（ALB）和肾功能3项［胱抑素C（Cys C）、肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）］，RT-PCR法检测肾组织Klotho蛋白和Klotho-mRNA表达及肾组织匀浆中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和乳酸脱氢酶（LDH）含量。结果模型组肾组织匀浆中Klotho蛋白和Klotho-mRNA与假手术组比较下调（均P＜0.05）；模型组大鼠心室内血STP和ALB治疗后与假手术组比较差别不大（均P＞0.05）。实验组Klotho蛋白、Klotho-mRNA、STP和ALB与模型组比较均升高（均P＜0.05）。模型组心室内血清SOD与假手术组比较降低，而MDA升高（均P＜0.05），LDH则差别不大（P＞0.05）。实验组MDA与模型组比较降低，SOD活性增强（均P＜0.05）。模型组Cys C、Scr、BUN和UP与假手术组比较均升高（均P＜0.05）。实验组Cys C、Scr、BUN 和UP与模型组比较均降低（均P＜0.05）。结论冬虫夏草菌粉在抑制肾缺血-再灌注造成的脂质过氧化反应的同时，免疫力得以提升，并通过上调Klotho蛋白和lotho-mRNA达到抗衰老、增加UP排泄来减轻肾功能损害。

肾缺血-再灌注损伤冬虫夏草菌粉Klotho基因免疫调节肾功能大鼠

【Abstract】Objective：To establish the rat renal ischemia-reperfusion injury animalmodel，to observe the effect of Cordyceps sinensis on the Klotho gene and immune regulation of the anti-ischemia-reperfusion injury and immune regulation mechanism.Methods：30 Wistar rats were random ly divided into sham operation group，the model group and the experimental group.Themodel group and the experimental group weremodelled with reperfusionmethod 45min after clamping bilateral renal，sham operation group without clamping bilateral renal as control.After operation，the experimental group received 10%Cordyceps powder，with gavage of 2.0mL/（kg·d），sham operation group and themodel group with 2.0mL/（kg·d）irrigation saline as control.7 days after gavage administration，urine phosphorus（up）contentwas detected；heart blood sampleswere taken formeasurement of STP，ALB and renal function in three［Cys C，SCRand BUN］.Rats were sacrificed from the right kidney and detected through RT-PCR to detect Klotho protein and Klotho-mRNA expression，then the contentof MDA，SOD and LDH in renal tissue.Results：Compared with the model group，STP，ALB and SOD in the experimental group increased；Klotho protein and Klotho-mRNA significantly up-regulated；Cys C，SCR，BUN and UP decreased，and MDA was significantly inhibited（P＜0.05）.Compared with sham operation group，Klotho protein and Klotho-mRNA significantly down-regulated in the model group（all P＜0.05）；there was little difference between the two groups in STP and ALB after treatment（all P＞0.05）.Compared with themodel group，Klotho protein，KlothomRNA，STP and ALB in the experimental group rose（all P＜0.05）.Compared with the sham operation group，the serum SOD in themodel group was lower，while the MDA was increased（all P＜0.05）.Compared with themodelgroup，MDA activity of the experimental group decreased，and the activity of SOD was enhanced（all P＜0.05）.Cys C，Cr，BUN，UP and Cys in themodel group were higher than that in the sham operation group（all P＜0.05）.Cys C，Cr，BUN，UP and Cys in the experimental group was lower than that of themodel group（all P＜0.05）.Conclusion：Cordyceps sinensis can inhibit lipid peroxidation caused by renal ischemia reperfusion injury；immunity can be improved，and through the regulation of Klotho protein and klotho-mRNA，it can have an effect of anti-aging and ramped-up excretion to reduce renal damage.

【Key words】Renal ischemia-reperfusion injury；Cordyceps sinensis；Klotho gene；Immune regulation；Rat

肾缺血-再灌注损伤（IRI）导致的缺血性急性肾功能衰竭（ARF）病死率极高，存活者多转变为终末期肾病［1］。IRI包括肾血流再通后再灌注损伤和肾缺血性损伤［2］。IRI肾功能损伤与机体氧化应激密切相系，因此，抗氧自由基或及时清除氧自由基可能改善IRI造成的急性肾功能损伤［3］。现代医学证实Klotho基因在肾组织表达上调可改善肾功能并达到抗衰老作用［4］，并且利用滋补性中药冬虫夏草进行肾缺血预处理和控制自身免疫反应可减轻肾细胞毒性反应，减轻肾小管上皮细胞损伤，促进肾小管细胞功能恢复而达到调节自身免疫和治疗作用［5］。在本研究中，笔者应用冬虫夏草菌粉对IRI进行干预和治疗，通过比较大鼠肾组织Klotho基因表达及酶学等指标改变来探讨冬虫夏草菌粉对大鼠IRI的保护作用机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物雄性Wistar大鼠30只，周龄39～40周，体质量182～193 g。大鼠许可证为SCXK（鄂）2011-0008，由湖北医药学院实验动物中心提供［SYXK（鄂）2011-0031］。实验尽量减少实验动物，减轻动物术中疼痛，创口消毒时尽量减少动物的疼痛和不适等，满足实验动物基本福利要求［6］。室内温度恒定在20～22℃，湿度60%～80%。术后单笼饲养，24 h交替光照，普通饲料喂养，动物自由饮水，每日室内紫外线消毒并及时清理粪便。

1.2药物与试剂冬虫夏草菌粉购自杭州华东制药（批号：20120121），使用前用注射用水配制成10%混悬液；戊巴比妥钠（北京化学试剂公司，德国进口分装，批号：061222）；丙二醛（MDA）、乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；大鼠可溶性Klotho蛋白检测试剂盒及RT-PCR检测试剂盒购自深圳市科润达生物工程有限公司。

1.3造模与分组30只大鼠采用随机数字表随机分为假手术组、模型组和实验组共3组，各10只。参照文献［7］造模，术前动物均禁食12 h，不禁水。3%戊巴比妥钠腹腔注射（1mL/kg）麻醉，动物麻醉后腹部向上仰卧位固定于鼠台，整个腹部碘伏消毒后用75%酒精脱碘，自剑突下2 cm腹部正中切开长1.5～2.0 cm切口，逐层分离皮肤和大网膜，采用37℃无菌生理盐水浸泡过的无菌纱布包裹胃、肠等器官防止器官干燥坏死。用玻璃分针顺腹主动脉向下找到双侧肾脏动脉并分离干净肾脏周脂肪及结缔组织，用动脉夹夹闭双肾动脉45min后松开动脉夹复灌的方法造模。一般在夹闭双肾30min左右后可见肾脏由鲜红逐渐变紫黑色，说明血液阻断成功动脉。45min后去掉动脉夹复灌，恢复血流后可见肾脏由紫黑色迅速转变为鲜红色。造模后清理无菌纱布，分层关闭腹腔，缝合皮肤并用碘伏消毒。假手术组手术开腹并分离双肾动，但不夹闭双肾动脉，45min后关闭腹腔作为对照。肌肉注射庆大霉素预防感染（每日1次，连续3 d）。

1.4给药方法术后实验组给予10%冬虫夏草菌粉2.0 mL/（kg·d）灌胃，假手术组和模型组则给予2.0 mL/（kg·d）生理盐水。3组大鼠灌胃治疗7 d。

1.5标本采集与检测1）治疗7 d后再次麻醉动物，收集1 mL尿液检测尿磷（UP）含量，然后心脏采血1 mL置于0℃冰箱备用，检测时取1mL样品血于离心管（4500 r/min）离心5min，然后取上血清于检验科测定血清总蛋白（STP）、白蛋白（ALB）、肌酐（Scr）、胱抑素（Cys C）和尿素氮（BUN）等指标。2）采血完成后处死动物取肾，置于0℃冰箱备用，检测SOD、MDA和LDH含量时，取少量肾组织样本，研磨匀浆，严格按说明检测肾组织匀浆中SOD、MDA和LDH含量。3）参考文献［8］采用RT-PCR法检测Klotho基因，取动物肾组织样本用Trizol法提取总RNA，逆转录合成cDNA，PCR扩增目的基因Klotho片段，上游引物5′-GTTTCT GCTGCCTTGTAT-3′；下游引物5′-ACTATGTCGCTTT CTTGG-3′。93℃预变性5min，61℃退火1min，71℃延伸50 s，35个循环，72℃延伸10min。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统拍照分析条带灰度值以确定Klotho-mRNA表达量。

1.6统计学处理应用SPSS17.0统计软件处理。计数资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠Klotho基因、STP和ALB水平比较见表1。结果示，模型组肾组织匀浆中Klotho蛋白和Klotho-mRNA与假手术组比较下调（均P＜0.05），血STP和ALB治疗后与假手术组比较差别不大（均P＞0.05）。实验组Klotho蛋白、Klotho-mRNA、STP和ALB与模型组比较均升高（均P＜0.05）。

表1　各组大鼠K l o t h o基因、STP和ALB水平比较（±s）

与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

组别n实验组10假手术组10模型组10 Klotho蛋白灰度值Klotho-mRNA灰度值STP（g/L）ALB（g/L）152.17±17.14△109.26±14.35△57.25±7.68△29.17±4.61△101.57±14.73 73.01±11.22 47.25±7.02 23.42±3.27 72.57±9.25*51.85±7.34*46.35±6.76 22.39±4.81

2.2各组大鼠肾组织匀浆中MDA、LDH和SOD水平比较见表2。结果示，模型组心室内血清SOD与假手术组比较降低，而MDA升高（均P＜0.05），LDH则差别不大（P＞0.05）。实验组MDA与模型组比较降低，SOD活性增强（均P＜0.05）。

表2　各组大鼠肾组织匀浆中MDA、LDH和SOD比较（±s）

组别n SOD（U/L）实验组10 130.52±20.57△假手术组10 127.21±15.46模型组10 80.55±13.37*MDA（nmoL/mL）LDH（U/L）3.03±0.17△375.71±67.29 2.51±0.33 372.07±59.35 7.01±0.52*379.75±71.04

2.3各组大鼠Cys C、Scr、BUN和UP水平比较见表3。结果示，模型组Cys C、Scr、BUN和UP与假手术组比较均升高（均P＜0.05）。实验组Cys C、Scr、BUN和UP与模型组比较均降低（均P＜0.05）。

表3　各组大鼠肾功能Cy s C、Sc r、BUN和UP比较（±s）

组别n实验组10假手术组10模型组10 CysC（mg/L）Scr（μmol/L）BUN（mmol/L）UP（mg/L）17.25±9.17△90.03±12.11△30.57±5.86△12.21±4.09△15.51±3.56 52.57±7.31 27.27±5.41 12.01±4.43 42.72±9.51*143.71±15.50*39.53±6.32*20.25±7.09*

3　讨论

冬虫夏草是由蝙蝠蛾科昆虫幼虫感染麦角菌科真菌后形成复合体［8］。虫草含有多种氨基酸、多糖、核苷及甾醇类等化学成份，其中虫草多糖具有护肾、抗炎及增强免疫力等作用，《本草从新》记载虫草“保肺益肾、止血化痰”之功效，是我国重要的滋补性中药［9］。在治疗手术创伤、药物肾毒等急慢性肾功能损害性疾病时，冬虫夏草主要通过改善肾小管滤过和重吸收等代谢机制，增加Cys C、Scr、BUN和UP的排泄率，减少尿蛋白和肾脏病理改变而发挥改善肾功能的作用［10］，同时冬虫夏草还具有明显的抗衰老及提高免疫力作用，在多病因造成的急慢性肾功能损害被作为免疫调节剂而广泛应用并取得了可靠疗效［10］。

本实验研究中所用冬虫夏草菌粉的药理成分与中药冬虫夏草一致，在用其灌胃治疗7 d后，实验组Klotho蛋白和Klotho-mRNA上调，UP则降低。肾脏保护性因子Klotho基因主要在大脑脉络膜和肾脏肾小管上皮细胞上表达。Klotho基因是Kuro等在1997年在小鼠模型中被发现，是一种新型抗衰老基因-Klotho，Klotho具有抗氧化、调节钙磷代谢和抗凋亡等多种作用［11］，Klotho基因表达上调能够延缓人类衰老，在调整机体磷代谢中也起到重要作用，Klotho主要在肾组织尤其在肾小管上皮细胞上表达，故其表达下调是肾损伤的标志，Klotho高表达可减缓肾脏损伤促进损伤肾小管内皮修复，其基因上调可调整机体磷代谢、保护肾功能而延缓人类衰老［4］。冬虫夏草上调Klotho基因的机制不太明确，冬虫夏草菌粉吸收后有可能参与拮抗膜外的磷对细胞的毒性作用，抑制肾小管上皮细胞凋亡，增加UP的排泄而减缓肾缺血-再灌注损伤。实验组Cys C、Scr、BUN和肾组织匀浆中MDA降低，提示冬虫夏草菌粉能明显降低肾缺血-再灌注损伤动物模型大鼠肾功能的作用；同时SOD升高，提示冬虫夏草菌粉减少肾缺血-再灌注MDA和氧自由基的产生，抑制肾缺血-再灌注后脂质过氧化反应而达到保护肾功能的目的。冬虫夏草菌粉保护肾缺血-再灌注肾脏机制可能与其增加肾小管对Cys C、Scr和BUN的排泄率，改善肾小管滤过和重吸收，促进肾缺血-再灌注后脂质过氧化反应受到损伤的肾小管细胞修复，抑制醛糖还原酶和肾小球代偿性肥大，降低肾小管和集合管对Na+、K+重吸收而减轻肾组织水肿有关［12-13］。冬虫夏草中的腺苷可提高SOD活性，在清除自由基和降低脂质过氧化产物MDA方面已有大量实验报道，在改善肾缺血-再灌注肾血流和肾功能等起着重要作用［14］。实验组大鼠STP、ALB亦升高，研究证实冬虫夏草菌粉对免疫系统具有双向调节作用，一方面可降低细胞免疫（降低T淋巴细胞吞噬功能），另一方面提高体液免疫（STP、ALB）而达到提高免疫力，这与宋艳丽、刘江等报道冬虫夏草菌粉具有增强免疫功能和抗氧化保护肾功能作用一致［14-15］。

综上所述冬虫夏草可通过“补虚损、益精气、实腠理”［16］，并上调Klotho基因和增加UP排泄，提高SOD活性来抑制肾缺血-再灌注后氧自由基生成、提高免疫力、减轻肾功能损害而达到肾缺血-再灌注损伤的保护作用。

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