氨基酸供给与内分泌互作调控乳蛋白合成的研究进展

徐连彬　林雪彦　胡志勇　王　云　王中华

(山东农业大学动物科技学院，泰安271018)



氨基酸供给与内分泌互作调控乳蛋白合成的研究进展

徐连彬林雪彦胡志勇王云王中华*

(山东农业大学动物科技学院，泰安271018)

限制性氨基酸研究是泌乳奶牛研究的热点之一，关于其影响乳蛋白合成途径而进行的一系列体内外研究表明：底物效应可能不是主要原因，更重要的是氨基酸及其构成作为信号因子对神经内分泌和细胞内信号通路的影响。本文从乳蛋白合成的影响因素入手，概括了氨基酸供给、激素分泌及二者相互作用对乳蛋白合成的调节，以期为阐明氨基酸供给影响乳蛋白合成的途径提供一定理论参考。

氨基酸；内分泌；互作调控；乳蛋白合成；研究进展

氨基酸供给包括氨基酸种类、比例和水平3个方面，其对乳蛋白合成有重要的影响。有关改变必需氨基酸(EAA)供给影响乳蛋白产量的试验已证实了这一点[1-2]。传统的氨基酸营养理论用“木桶原理”来解释氨基酸构成对乳蛋白合成的影响。该理论认为，相对于需要量供给最为短缺的EAA在补充到一定水平前，补充其他氨基酸没有效果。事实上，无论在生长动物还是泌乳动物上，均发现存在“共限制”氨基酸现象，即补充不同EAA均促进了乳蛋白的合成，从而证实了该理论的局限性[3-5]。与生长动物不同，泌乳反刍动物对单一EAA供给变化响应不敏感。Bequette等[6]发现，奶山羊真胃灌注混合氨基酸中缺失组氨酸(His)，其动脉浓度下降了近90%，而乳蛋白产量却变化不显著。尽管如此，作为构成乳蛋白的基本单位，氨基酸的底物功能仍然不能忽视。Appuhamy等[7]观察到，蛋氨酸(Met)和苏氨酸(Thr)不影响乳腺上皮细胞内的信号途径，但影响酪蛋白合成速度，其作用途径可能是底物效应。Eif等[8]研究表明，限制单一EAA供给量，所限制EAA的细胞内受体tRNA载荷可降至零，而其他氨基酸的受体tRNA仍满载荷，各密码子的翻译速度因可利用底物数量的变化出现很大差异。乳腺氨基酸代谢研究表明，单一EAA缺乏可以通过提高乳腺血流量(MBF)和缺乏EAA的乳腺提取效率来增加对乳腺组织的供应[6]。因此，限制性氨基酸乳腺供给量减少可能不是引起乳蛋白产量下降的主要原因，已有的研究表明存在2种其他的途径。一是氨基酸供给影响乳腺上皮细胞内调节蛋白质合成的信号通路，主要包括：1)哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路。细胞氨基酸营养改变信号刺激该途径对核糖体S6蛋白激酶1(ribosomal protein S6 kinase 1,rpS6K1)和真核细胞翻译启动因子4E结合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1,4EBP1)的磷酸化，从而促进胞内蛋白质合成的翻译过程[9]。2)整合应激(integrated stress response,ISR)网络。细胞氨基酸营养不足时，增加的空载tRNA刺激真核细胞翻译启动因子2(eukaryotic translation initiation factor 2,eIF2)的磷酸化，从而抑制胞内蛋白质合成的翻译起始[10]。二是限制或增加EAA供给引起血浆激素浓度的变化，后者可通过组织代谢、细胞增殖和转录翻译等多个水平调控乳蛋白合成。一个比较一致的规律是限制单一或一组EAA供给，血浆胰岛素(INS)和胰高血糖素(GLN)浓度同时升高。2006—2012年发表的6个相关研究[1,11-15]都观察到了这一现象。因此，内分泌变化是影响乳蛋白合成的重要因素，EAA供给-内分泌变化-乳蛋白合成是一个值得关注的EAA供给影响乳蛋白合成的途径，本文将对与此相关的研究进行综述。

1　氨基酸供给对内分泌激素的影响及作用途径

泌乳奶牛的下丘脑-垂体系统及乳腺细胞分泌的激素影响体内游离氨基酸的利用，反之游离氨基酸也可能对神经内分泌系统产生反馈性调节。陈智梅[16]根据氨基酸平衡指数调整培养基中Met、赖氨酸(Lys)和亮氨酸(Leu)的比例，结果发现不同氨基酸模式影响离体乳腺组织中激素的合成与分泌。体外一系列的EAA灌注试验支持这一结论，例如：静脉灌注分别缺失Met、Lys、His和支链氨基酸(BCAA)的混合氨基酸显著改变了泌乳奶牛血浆中几种激素的浓度[1]；小鼠腹腔注射精氨酸(Arg)后，INS和GLN的分泌量均显著增加[12]。由此看出，激素分泌的刺激效果与氨基酸种类存在一定的关系。Kuhara等[17]通过绵羊静脉灌注试验发现，酸性氨基酸主要促进生长激素(GH)的分泌，中性直链氨基酸主要促进INS和GLN的分泌，而BCAA趋于抑制GLN的分泌。除作用于分泌外，氨基酸还能影响激素的组织敏感性及其受体的表达。Xiao等[18]发现，BCAA缺乏可以提高肝脏INS的敏感性。EAA缺乏未必影响血浆GH和胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)的浓度，但可以影响肝细胞GH和IGF-Ⅰ受体的表达[19]。

无论是缺失还是增加EAA，均可引起氨基酸的不平衡，因而可能是氨基酸不平衡而非单一氨基酸信号刺激了激素的分泌。关于氨基酸调节激素分泌机制的报道较少，根据前人的研究结果概括如下：首先，某些特殊氨基酸本身作为底物参与小分子质量激素的合成。酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)是肾上腺素和甲状腺激素合成的前体。其次，氨基酸可能通过细胞内信号途径直接调节激素的分泌。研究表明氨基酸混合物对INS分泌的刺激作用50%以上通过谷氨酰胺(Gln)来实现，其胞内信号途径为环磷酸腺苷-蛋白激酶A(cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A,cAMP-PKA)通路[20-21]。马秀玲[22]指出，Arg可以在转录和翻译水平对肝脏IGF-Ⅰ的合成进行调节，涉及的可能环节包括转录速率、核-胞浆运输以及转录后的加工修饰。Xiao等[18]发现，BCAA缺乏通过mTOR和腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)通路增加肝脏中INS的敏感性。在组织细胞感受氨基酸信号的过程中，氨基酸载体可能起到关键的作用，即所谓的“转运感受子”(transceptor)[23]，如Leu等中性氨基酸载体可与胞内mTOR通路发生交互作用而传递信号[24]。最后，单一氨基酸或氨基酸平衡可能通过血浆代谢物间接发挥调节作用。王建发[25]体外培养奶牛垂体细胞时发现，Arg通过生成一氧化氮(NO)促进胞外Ca2+内流，从而调节GH的分泌；Tyr通过生成多巴胺并以自分泌或旁分泌的方式抑制催乳素(PRL)的分泌。与外源灌注速率增加相比，肝脏对EAA的利用速率增幅更大，其糖异生的代谢产物葡萄糖对INS和GLN的分泌具有直接的刺激作用[26-27]。此外，有研究报道氨基酸供给可能通过增加肠道细胞分泌胃饥饿素(ghrelin)来促进INS和GH的分泌[11]。ghrelin是一种由胃黏膜内分泌细胞分泌的脑肠肽，当其与GH分泌细胞膜表面的生长激素促分泌物受体(growth hormone secretagogue receptor,GHSR)结合后激活蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)并提高核内环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)的磷酸化水平，后者与GH基因的启动子区特异性结合后促进GH基因的转录[28]。

2　内分泌激素对乳蛋白合成的影响及作用途径

Cant等[29]对乳腺氨基酸代谢的相关研究进行了综述，并指出：乳蛋白合成速度决定于动物的生理状态、营养状况和挤奶制度，而非胞外氨基酸浓度。大量数据证实，泌乳奶牛体内存在一系列针对氨基酸缺乏而优先满足泌乳的机制，其中内分泌系统是一个重要的方面。综合以往的研究结果，我们发现激素对乳蛋白合成的调控是在细胞、组织、器官和机体各个层次的集成调控，其具体途径可能包括：1)调节机体代谢并促进营养物质向乳腺的分配。奶牛机体自身存在营养调控功能，当氨基酸缺乏时，其可以通过协调分配在一定时间内保持稳态，激素在维护机体这一功能方面起到非常重要的作用。吴慧慧等[30]指出，反刍动物泌乳期营养分配的主要调节因子是激素，其影响稳态信号应答的机制可能包括改变组织受体及其动力学、细胞内信号传导体系及生化通路中关键酶的表达和活性；此外，不同组织在氨基酸补偿调控这一过程中可以相互协调，共同促进营养物质向乳腺的转移。2)促进乳腺的发育并维持泌乳过程。3)调节氨基酸载体的表达和活性[31]。4)促进乳蛋白合成相关基因的转录和翻译，如图1所示。下面以PRL、INS、IGF-Ⅰ、GH和GLN为例，从分子、细胞、组织、器官和机体多个水平对其具体的作用机制加以论述。

IGFBP：胰岛素样生长因子结合蛋白 insulin-like growth factor binding protein；TGFα：转化生长因子α transforming growth factor α；TGFβ：转化生长因子β transforming growth factor β；Leptin：瘦素；FGF：纤维母细胞生长因子 fibroblast growth factor；stromal cells：基质细胞；IRS-1：胰岛素受体底物1 insulin receptor substrate 1；RAS：大鼠肉瘤蛋白 rat sarcoma protain；β-Catenin：β-连环蛋白；Cell survival：细胞存活；Cell proliferation：细胞增殖；SOCS：细胞信号因子抑制因子 suppressors of cytokine signaling；JAK/STAT5 Signaling：Janus激酶/信号转导与转录激活子5信号；Prl：催乳素 prolactin；GH：生长激素 growth hormone；Milk Protein Gene Expression：乳蛋白基因表达；KEY：图例；Prl or GH receptor：催乳素或生长激素受体；IGF-Ⅰ receptor：胰岛素样生长因子Ⅰ受体；Hybrid receptor：混合受体；Insulin receptor：胰岛素受体；Fibroblast or adipocyte：纤维母细胞或脂肪细胞；ECM protain：细胞外基质蛋白 extracellular matrix proteins。

图1IGF-Ⅰ、PRL、GH和其他生长因子对奶牛乳腺上皮细胞的作用

Fig.1Actions of IGF-Ⅰ, PRL, GH and selected growth factors in a bovine mammary epithelial cell[42]

2.1PRL

PRL是由腺垂体催乳素细胞合成并分泌的一类单链多肽类蛋白激素，由199个氨基酸组成，广泛分布于垂体以外的组织器官。PRL在发动并维持泌乳、刺激乳腺生长发育和促进乳蛋白合成方面具有十分重要的作用。杨建英等[32]发现，泌乳奶牛乳蛋白含量增加的同时会伴随着血浆PRL浓度的升高。添加PRL显著提高了离体奶牛乳腺上皮细胞的乳蛋白分泌量[33]。Boutinaud等[34]采用PRL抑制剂处理泌乳奶牛，发现κ-酪蛋白和PRL受体(PRLR)的mRNA表达丰度均显著下降。

PRL调控乳蛋白合成的机理可能有以下几个方面：一是PRL促进乳腺发育并影响泌乳的维持。妊娠末期，PRL通过增加基因转录和延长mRNA寿命控制小叶腺泡的发育及小叶上皮细胞的增殖[35]，参与调控该过程的是细胞内丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路。喹高利特，一种PRL抑制剂，可以显著降低泌乳高峰期奶牛的产奶量[36],这可能与PRL功能抑制阻碍了乳腺上皮细胞的增殖，使正常泌乳细胞数减少有关。二是PRL与受体结合后通过胞内磷脂酰肌醇3激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶(phosphatidylinositol 3 kinase-serine/threonine kinase,PI3K-Akt)通路和Janus激酶-信号转导与转录激活子5(Janus kinases-signal transducer and activator of transcription 5,JAK-STAT5)通路诱导乳蛋白基因的转录[37]。PRLR是具有细胞因子受体超家族结构特性的跨膜蛋白，包括膜外域、跨膜域和胞内域3个部分。当PRLR与PRL结合后发生二聚化，其胞内结构域与酪氨酸激酶进行交叉磷酸化并激活Janus激酶(Janus kinases,JAK)和信号转导与转录激活子(signal transducer and activator of transcription,STAT)，后者进入细胞核后与乳蛋白基因上的特定序列相结合，启动基因的转录[38]。三是PRL可以调节氨基酸的转运[39]。Lacasse等[36]发现，PRL调节L-氨基酸转运载体的活性。研究发现，用PRL阻断剂溴隐亭处理泌乳高峰期的大鼠后改变了几种氨基酸的乳腺动静脉浓度差，而且这种差异可被外源性的PRL处理所恢复[40]。此外，PRL与INS、孕激素、糖皮质激素和雌激素等多种激素存在协同作用，共同调节乳蛋白的合成[41]。

2.2INS

INS是一种由胰脏内胰岛β细胞分泌的蛋白质激素，分子质量为5 808 ku。作为体内唯一降低血糖浓度的激素，其对乳蛋白合成有重要的影响。研究表明，乳蛋白合成的内分泌调控主要是INS起作用[42]。Mackle等[43]采用高胰岛素-正常葡萄糖钳夹技术使血浆INS浓度增加4倍而血糖浓度维持恒定，并发现乳蛋白产量增加了15%，若再额外灌注酪蛋白，则乳蛋白产量进一步提高。小鼠静脉灌注Leu后，血浆INS浓度短暂升高，且这种变化促进了Leu诱导的蛋白质合成[44]。Menzies等[45]通过全基因表达分析筛选出了28个受INS刺激并与乳蛋白合成直接相关的基因，并证实INS在细胞内通过多个水平刺激乳蛋白合成。以上这些结果说明INS可以促进乳腺对氨基酸的利用，进一步发挥奶牛的泌乳潜能。

关于INS促进蛋白质合成的机理可以从2个角度加以阐述。细胞分子水平上，INS通过刺激胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1，IRS-Ⅰ)并借助配体的约束力和磷酸化诱导INS受体蛋白位点的生成，进而促进胞内蛋白质的合成[46]。首先，INS与乳腺上皮细胞上的INS受体结合后激活PI3K-Akt-mTOR信号通路促进蛋白合成的翻译[47]。mTOR对下游信号通路的作用具体表现为：刺激rpS6K1磷酸化并促进蛋白质翻译的起始和延伸过程[48]；刺激4EBP1磷酸化并促进真核生物起始因子4F(eukaryotic translation initiation factor 4F,eIF4F)复合物的形成，进而启动含帽子结构的mRNA翻译起始[49]；刺激真核细胞翻译延长因子2(eukaryotic elongation factor 2,eEF2)磷酸化并促进蛋白翻译的延伸过程[50]。泌乳发动后，乳腺乳蛋白基因mRNA表达量稳定，但Akt基因表达上调，提高了INS促进mRNA翻译的效率[51]。其次，INS通过JAK-STAT5信号通路诱导相关基因的转录[52]。作为一种重要的泌乳信号转导因子，STAT5可与激素介导和磷酸化的JAK信号通路偶联，活化的STAT以二聚体的形式进入细胞核内与乳蛋白基因上的启动子结合，启动基因的转录，从而把细胞外信号与基因表达调控直接联系起来[53]。组织器官水平上，INS通过对机体物质代谢、能量平衡及流向乳腺的底物浓度和转运进行调节，间接影响乳蛋白合成[39]。其中MBF的变化是一个重要途径，Mackle等[43]报道，INS可以提高MBF。Cant等[29]在其综述中认为MBF的改变可以解释为乳腺面对机体循环血液中能量底物浓度不足时，尝试恢复细胞内ATP平衡的结果。吴慧慧等[30]证实，INS可以通过增加肝脏葡萄糖的合成满足泌乳的能量需要，从而促进乳蛋白合成。此外，INS还与其他激素如GH、PRL等存在信号转导交叉，共同构成一个信号网络参与调控乳蛋白的合成。

2.3IGF-Ⅰ

IGF-Ⅰ是由GH诱导靶细胞产生的一种与INS有高度同源性的多功能碱性多肽，由70个氨基酸组成，分子质量为7.5 ku，是细胞增殖与分化的重要调控因子。循环血液中95%的IGF-Ⅰ由肝脏分泌，其合成依赖于垂体分泌的GH和机体营养状况。IGF-Ⅰ通过与血液中的胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor binding protein，IGFBP)结合后被运输到外周组织发挥作用。Rose等[54]发现，血液中IGF-Ⅰ浓度通常与泌乳量呈正相关，提示其对乳蛋白合成有一定的促进作用。Prosser等[55]向泌乳山羊阴外动脉注射IGF-Ⅰ后发现乳分泌速率提高了25%。

已经证实乳腺组织中存在IGF-Ⅰ受体，提示其可直接作用于乳腺发挥作用[56]。IGF-Ⅰ调控泌乳的机理可能包括：1)调控乳腺上皮细胞的增殖、分化和凋亡。IGF-Ⅰ可以加快细胞周期进程，促进细胞分裂并刺激细胞的生长[34]。青春期至成熟期的小鼠IGF-Ⅰ基因的过表达促进了乳腺导管分支和腺泡的形成[57]。关于其作用途径，Forsyth等[58]发现，IGF-Ⅰ以内分泌、自分泌和旁分泌的方式调控细胞的生长与分化。当IGF-Ⅰ与其受体的α亚基结合时，引起β亚基的磷酸化并激活下游信号转导通路，包括PI3K-Akt和MAPK通路[59]。MAPK在静止期细胞处于去磷酸化状态，当IGF-Ⅰ与其受体结合后解除了β亚基上的酪氨酸激酶抑制，促使MAPK激活并将信号传递到核内，启动有丝分裂过程[60]。2)促进乳蛋白合成的转录和翻译过程。Burgos等[61]证实，IGF-Ⅰ通过PI3K-Akt通路促进细胞内mRNA的翻译，且其作用效果与浓度相关。季昀等[62]向不含血清的奶牛乳腺上皮细胞培养液中补充IGF-Ⅰ，发现其可单独通过影响关键激酶及调节因子基因的转录来调控乳蛋白合成。3)促进动物体内营养物质向乳腺的分配。例如，IGF-Ⅰ能通过增加MBF来促进泌乳奶牛乳汁的分泌[63]。

2.4GH

GH是由动物脑垂体前叶嗜酸性细胞产生的一种不含糖的单链多肽，由191个氨基酸构成。GH在哺乳动物乳腺发育和泌乳维持方面同样具有促进作用。Eppard等[64]发现，脑垂体中GH浓度与奶牛泌乳量呈正相关。GH可以显著促进离体奶牛乳腺上皮细胞系中αs1-酪蛋白和α-乳白蛋白mRNA的表达[65]。用GH处理泌乳早期奶牛，产奶量与对照组相比提高了36%[66]。Flint等[67]同时抑制大鼠PRL和GH并给予外源GH处理，发现泌乳量显著增加，证实GH在促进乳蛋白合成方面具有独立的调控作用。

GH促进泌乳的途径大致分为2类：一是GH通过与其受体(GHR)结合而直接作用于乳腺上皮细胞[68-69]。GHR是单次跨膜蛋白质，属于Ⅰ类细胞因子受体超家族。Glimm等[70]运用Northern杂交发现了奶牛乳腺中GHR的存在，并证实GHR基因主要在腺泡上皮细胞中表达。二是GH通过刺激肝脏细胞产生IGF-Ⅰ，进而通过其内分泌和旁分泌的介导发挥作用[71]。Kleinberg等[72]发现GH可以促进乳腺组织自身IGF-Ⅰ mRNA的表达。因此，GH促进乳蛋白合成的作用机制与IGF-Ⅰ相类似，包括：1)促进乳腺细胞的增殖和发育[73]。GH可以诱导小鼠乳腺腺泡的发育[74]。青年母牛注射GH后乳腺细胞数增加了近50%[75]。2)促进乳蛋白合成相关基因的转录和翻译。Hayashi[53]发现，GH介导PI3K-Akt通路和胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinases,ERK)通路影响胞内mTOR的磷酸化。Malewski等[76]发现，GH通过JAK-STAT5信号通路促进乳蛋白基因的表达。3)促进体内营养物质向乳腺的分配[77]。一方面，GH通过调节其他组织的代谢过程满足奶牛泌乳的需求。Knapp等[78]指出，GH可以提高肝脏糖异生和氧化速率来支持乳蛋白合成的能量需要。另一方面，GH通过提高MBF促进乳腺对前提物的提取。Chaiyabutr等[79]发现，注射GH可以改变奶牛的MBF。

2.5GLN

GLN是一种由胰腺胰岛α细胞分泌、29个氨基酸构成的直链多肽。与INS相反，GLN是一种促进分解代谢并增加血糖浓度的激素，其可以通过刺激磷酸化酶促进肝脏对循环氨基酸的摄取和利用。已有研究证实GLN对乳蛋白合成有抑制作用，例如：Bobe等[80]发现，无论限制饲喂还是自由饲喂，给泌乳奶牛静脉灌注GLN均极显著降低了乳蛋白产量；She等[81]给产后21 d的奶牛连续14 d静脉灌注GLN，乳产量显著降低。

有报道奶牛泌乳的发动与循环GLN浓度升高有一定的关系[82]。Donkin等[83]指出，GLN可以促使肝脏摄取更多的氨基酸用于糖异生和尿素循环，因此肝脏游离氨基酸浓度下降，从而降低了乳蛋白产量。以往的研究很少关注GLN对乳蛋白合成的具体影响，但有趣的是，单一EAA缺乏试验多数情况下观察到了INS和GLN浓度的同时升高，目前还不清楚GLN浓度升高是否会干扰INS对乳蛋白合成的促进作用，有关这方面的内容值得进一步探究。

3　小结与展望

综上所述，氨基酸及其构成可以作为信号分子参与各种代谢过程。PRL、INS、IGF-Ⅰ、GH和GLN在调控乳蛋白合成方面具有重要作用，其分泌受到氨基酸供给的调节。关于氨基酸构成影响激素分泌及激素影响乳蛋白合成的机制，目前的研究虽建立了一定基础，但还不是十分明确。未来的研究可采用体外法从分子水平关注这2个方面，重点是已经报道的几种信号氨基酸。其结果有助于构建氨基酸影响乳蛋白合成的神经内分泌调控网络，为探索饲粮理想氨基酸构成及提高奶牛氮泌乳转化效率提供一定的帮助。

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(责任编辑菅景颖)

, professor, E-mail: zhwang@sdau.edu.cn

Recent Advances in Regulating Milk Protein Synthesis by Interaction of Amino Acid Supply and Endocrine

XU LianbinLIN XueyanHU ZhiyongWANG YunWANG Zhonghua*

(College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China)

Limiting amino acid is one of hot topics in dairy cows studies. Previous researches, bothinvitroandinvivo, show that amino acid supply and profile play a major role in milk protein synthesis by endocrine and intracellular signaling pathways rather than substrate. Focusing on the influencing factors of milk protein synthesis, this paper reviewed the regulation of amino acid supply, hormone secretion and their interaction on milk protein synthesis, which might provided a theoretical reference for elucidating the pathways of milk protein synthesis affected by amino acid supply.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(8)：2324-2333]

amino acid; endocrine; regulation of interaction; milk protein synthesis; recent advances

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.08.002

2016-03-03

国家自然科学基金面上项目(31372340)

徐连彬(1988—)，男，山东莒南人，博士研究生，从事反刍动物营养与生理研究。E-mail: lbxu0814@163.com

王中华，教授，博士生导师，E-mail: zhwang@sdau.edu.cn

S852.2

A

1006-267X(2016)08-2324-10