原花青素对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关基因蛋白表达的影响

刘丹，王高频，常清华，刘义



基础与实验研究

原花青素对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关基因蛋白表达的影响

刘丹，王高频，常清华，刘义

目的：观察原花青素对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡相关基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、B型白细胞/2型淋巴细胞样蛋白（Bcl-2）和凋亡相关基因Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）蛋白表达的影响，探讨原花青素在大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡中发挥的作用及可能的调控机制。

方法：40只雄性SD大鼠随机等分为4组，即正常组，模型组，原花青素低剂量组［原花青素 50 mg/（kg·d）］，原花青素高剂量组［原花青素 100 mg/（kg·d）］，灌胃给药，每天1次，连续2周。末次给药后结扎冠状动脉左前降支（LAD） 30 min再灌注 120 min，建立大鼠心肌缺血再灌注模型。测定肌酸激酶同工酶（CK-MB）活性、心肌梗死面积；用Western blot检测各组细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达；原位末端转移酶标记（TUNEL）法检测心肌细胞凋亡。

结果：与正常组比较，模型组大鼠CK-MB活性显著增强、心肌梗死面积增大，心肌细胞凋亡指数升高，Caspase-3、Bax蛋白表达增强，Bcl-2蛋白表达、Bcl-2/Bax降低（P＜0.05）；与模型组比较，原花青素高、低剂量组大鼠CK-MB活性显著减弱、心肌梗死面积减小，细胞凋亡指数显著降低，Caspase-3、Bax蛋白表达显著减弱，Bcl-2蛋白表达、Bcl-2/Bax增加（P＜0.05）。

结论：原花青素可拮抗缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡，其机制可能与Caspase-3、Bax蛋白表达降低，Bcl-2表达升高，Bcl-2/Bax比例增加有关。

心肌再灌注；原花青素；细胞凋亡

Abstract

Objective： To observe the effects of procyanidins on myocardial apoptosis and related protein expressions of caspase-3， Bcl-2 and Bax in experimental rats with ischemia reperfusion （I/R） injury and to explore the possible mechanism.

Methods： A total of 40 male SD rats were randomly assigned to 4 groups： Sham group， IR group， Low-dose procyanidin （50 mg·kg-1） group， and High-dose procyanidin （100 mg·kg-1） group. n=10 in each group and the rats were pre-treated by intra gastric drug administration once/day for 2 weeks， then left anterior descending artery （LAD） occlusion was conducted for 30 minutes followed by reperfusion for 120 minutes to establish IR model. Blood levels of CK-MB activity and myocardial infarction （MI） size were examined； protein expressions of caspase-3， Bcl-2 and Bax were determined by Western blot analysis； myocardial apoptotic index was measured by TUNEL method.

Results： Compared with Sham group， IR group presented the higher CK-MB activity， enlarged MI size， increased index of apoptosis， elevated protein expressions of caspase-3 and Bax， while reduced protein expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax，P＜0.05. Compared with IR group， both Low-dose and High-dose procyanidin groups had the lower CK-MB activity， smaller MI size，decreased index of apoptosis， reduced protein expressions of caspase-3 and Bax， while elevated protein expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax， P＜0.05.

Conclusion： Procyanidin could reduce myocardial apoptosis index in experimental IR rats， which might be related to decreased protein expressions of caspase-3 and Bax， increased protein expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax.

（Chinese Circulation Journal， 2016，31：696.）

急性心肌梗死早期再灌注治疗，无论是溶栓或急诊经皮冠状动脉（冠脉）介入治疗，都是心肌挽救最实用和最广泛采用的方法［1， 2］。然而，人们发现在心肌组织血流恢复后反而出现了组织细胞损伤加重的状态，即缺血再灌注损伤，引起心肌功能障碍及心律失常的发生，严重影响患者预后［3］。如何减轻再灌注损伤已经成为目前的研究热点。原花青素是一类在植物中广泛存在的多酚类化合物的总称。近年来，关于原花青素的生理活性和药理作用的研究不断增多。在心血管系统中，它具有多种生物活性如血管舒张活性、抗氧化、改善内皮功能、抗炎、抗血小板聚集等功效［4， 5］。我们实验室前期研究显示原花青素可以通过抑制活性氧-p53-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（ROS-p53-Caspase-9）途径明显减少大鼠心肌缺血再灌注后的细胞凋亡［6］，本实验进一步研究原花青素通过调节Caspase-3和B型白细胞/2型淋巴细胞样蛋白（Bcl-2）、凋亡相关基因Bcl-2 相关X蛋白（Bax）蛋白的表达，保护大鼠心肌缺血再灌注损伤，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

材料：2014-09至2016-02选择健康成年雄性SD大鼠40只，体重250～300 g，由辽宁医学院动物实验中心提供［动物使用许可证号：SCXK（辽）2003-0007］。仪器：DH-150型动物人工呼吸机（浙江医科大学仪器实验厂）；电泳槽（美国Bio-rad公司）；DNM-9602G酶标分析仪（上海京工实业有限公司）；7170A型全自动生化分析仪（日本日立公司）。药品与试剂：原花青素（天津市尖峰天然产物研究开发有限公司，批号：20110739，纯度：＞95%），原位末端转移酶标记（TUNEL）细胞凋亡原位检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），兔抗大鼠Caspase-3、Bcl-2、Bax多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），三羟甲基氨基甲烷（TBS，辽宁医学院实验室提供）：三羟甲基胺基甲烷（Tris）12.1 g，Nacl 17.5 g，加双蒸水至 1500 ml，在搅拌下加浓Hcl至pH 7.4，再加双蒸水定容至2000 ml。

分组和给药：SD大鼠40只随机分为4组，每组10只：正常组（0.9%氯化钠盐水2 ml/ d ）、模型组（0.9%氯化钠盐水2 ml/d）、原花青素低剂量组［原花青素 50 mg/（kg·d）］、原花青素高剂量组［原花青素 100 mg/（kg·d）］。每天清晨灌胃，除正常组外，其他3 组2 周后建立大鼠心肌缺血再灌注模型。

模型的建立［7］：SD大鼠用10%乌拉坦（5 mg/kg）行腹腔麻醉后手术台固定，取颈正中切口，分离颈总动脉，准备实验结束时动脉插管取血，气管插管进行机械通气，于胸骨左旁第2～3 肋间行纵行切口，分离胸大肌及肋间肌，结扎肋间动静脉，剪断肋骨，破胸膜、心包膜。在左心耳下缘冠状动脉左前降支（LAD）起始部处用6.0 聚丙烯纺织纤维线穿线，留线暂不结扎，待血压、呼吸稳定10～15 min后再收紧结扎线，结扎之前在预结扎的LAD处放置一根长约0.5 cm、直径1.5 mm的乳胶管。LAD 缺血30 min 后再松开活结进行再灌注，再灌注120 min。冠脉LAD结扎成功标志：结扎线远端心肌颜色发绀，心电图表现为ST段进行性抬高和（或）T波高耸和（或）QRS高大增宽。再灌注成功标准：剪断结扎线后，心电图ST段回落50%以上或者缺血部位心肌颜色恢复［8］。

指标测定：肌酸激酶同工酶（CK-MB）活性、梗死面积测定：再灌注结束后120 min，颈动脉插管采血1.0 ml，119 g离心10 min，取血清置于-80℃贮藏，备用。应用全自动生化分析仪测定CK-MB活性［6］。颈动脉取血后，立刻取出心脏，置于生理盐水中，分离静脉、动脉和左右心室。将左心室称重，采用氯化硝基四氮唑蓝染色法，分离正常心肌和梗死心肌，分别称重，计算心肌梗死面积（即梗死心肌重量占左心室重量的比例）。TUNEL细胞凋亡原位检测方法检测细胞凋亡率， 再灌注结束120 min后，取出心脏，将缺血区心肌组织（左心室前壁中间段）剪下，10%中性甲醛固定24 h，常规石蜡包埋，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法，按照试剂盒说明进行心肌组织切片细胞凋亡的原位检测。光镜下正常心肌细胞核呈蓝绿色，凋亡细胞核呈深浅不一的棕褐色。每张切片于凋亡细胞分布区域各取5个高倍视野，计算出平均100个细胞中的凋亡细胞数，并以百分数（%）表示凋亡指数。免疫印迹法（Western blot）测定Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白的表达：取各组大鼠的心肌进行蛋白制样。取-80℃低温保存的心肌组织约100 mg，加入1 ml细胞裂解液，匀浆破碎，4℃下10297 g离心30 min 取上清液，二喹啉甲酸（ BCA） 法进行蛋白定量测定，制成含蛋白量相等的样品［7］。行SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳。然后将蛋白电转到硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉的TBS中封闭，加入一抗，4℃封闭过夜；第2天，TBS洗膜3次，加入辣根过氧化物酶偶联的二抗室温下摇床上孵育1 h；按Western blot发光试剂盒说明书显影，用图像分析软件Image J计算各蛋白的相对光密度值，以β-肌动蛋白（β-actin）为内参。

统计学处理：用SPSS16.0统计软件进行数据分析，数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较用SNK法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

原花青素对模型大鼠心肌CK-MB活性、心肌梗死面积的影响（表1）：与正常组相比，模型组的CK-MB活性水平、梗死面积显著增加；与模型组相比，原花青素低剂量组CK-MB活性、梗死面积显著减少；与原花青素低剂量组相比，原花青素高剂量组CK-MB活性、梗死面积显著减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表1 原花青素对缺血再灌注模型大鼠心肌CK-MB活性、心肌梗死面积的影响（±s， n=10）

表1 原花青素对缺血再灌注模型大鼠心肌CK-MB活性、心肌梗死面积的影响（±s， n=10）

注： CK-MB：肌酸激酶同工酶；-：无。与正常组相比*P＜0.05；与模型组相比△P＜0.05；与原花青素低剂量组▲P＜0.05

组别　CK-MB （U/L）　 全心重 （mg） 梗死区重 （mg） 梗死面积 （%）正常组　978.94±8.56　788.40±9.93　-　-模型组　5045.00±7.83*　733.72±9.54　286.28±10.03　38.97±1.33*原花青素低剂量组　3883.90±10.70△　820.62±6.87　252.57±8.43　30.78±0.83△原花青素高剂量组　2907.30±1.07▲　785.73±9.16　117.44±7.82　15.07±0.82▲

原花青素对模型大鼠心肌细胞凋亡的影响（图1）：TUNEL法检测结果显示：与正常组相比，模型组的心肌细胞凋亡指数明显增加［（4.55±0.62）% vs （21.87±1.00）%，P＜0.05）］；与模型相比，原花青素低剂量组的心肌细胞凋亡指数明显减少［（21.87±1.00）% vs （13.69±0.86）%，P＜0.05）］；与原花青素低剂量组相比，原花青素高剂量组的心肌细胞凋亡指数明显下降［（13.69±0.86）% vs （9.26±0.62）%，P＜0.05）］，差异均有统计学意义。

图1 原位末端转移酶标记（TUNEL）细胞凋亡分析方法显示原花青素对缺血再灌注模型大鼠心肌细胞凋亡的影响

原花青素对模型大鼠心肌组织Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响（图2A，2B，2C）：与正常组相比，模型组的Caspase-3、Bax蛋白表达明显上升，Bcl-2表达降低，Bcl-2/ Bax比例减小，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，原花青素低剂量组的Caspase-3、Bax蛋白表达明显降低，Bcl-2表达升高，Bcl-2/ Bax比例增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与原花青素低剂量组相比，原花青素高剂量组的Caspase-3、Bax蛋白表达明显降低，Bcl-2表达升高，Bcl-2/ Bax比例增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 原花青素对模型大鼠心肌组织Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤是指急性缺血的心肌再恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的现象［9］。它是由多种炎症因子及多细胞信号通路参与的复杂的炎症损伤反应，其具体机制涉及氧化应激，线粒体损伤及钙超载等［10］。研究发现［11］，细胞凋亡与心肌缺血再灌注损伤密切相关，细胞凋亡的数量决定心肌细胞损害的程度。近年来的研究发现，药物干预可以抑制心肌细胞的凋亡［12， 13］，降低心肌梗死的面积，对缺血再灌注心肌细胞有保护作用。细胞凋亡是由基因控制的有序化的主动死亡过程，在目前已知的凋亡调节蛋白中，Bcl-2 家族（ B 型白细胞/2 型淋巴细胞样蛋白）在各类刺激信号引起的凋亡中起到关键的作用［14］。包括抗凋亡基因和促凋亡基因两类，其代表分别为Bcl-2基因及Bax基因［15， 16］。Bcl-2 是一种抑制细胞凋亡的基因，Bax 则促进细胞凋亡。凋亡细胞内Bcl-2 和Bax 的平衡状态与凋亡调控直接相关： Bax 增高，促进细胞凋亡； Bcl-2 增高，抑制细胞凋亡。因而有人提出细胞在受凋亡刺激后的生存能力由Bcl-2与Bax的比率决定［17， 18］，Bcl-2表达水平较高时，比率上调，可形成Bcl-2/Bax的异二聚体，细胞凋亡受到抑制；Bax表达水平较高时，比率下调，可形成Bax/Bax同二聚体，导致细胞凋亡。Caspases激活的线粒体途经是调节机制比较明确的细胞凋亡过程。在Caspases激活的线粒体途经中，Caspases家族承担着重要的凋亡调控作用。其中Caspases-3是最重要的凋亡执行者。Bcl-2 是通过干扰细胞色素C 的释放而阻断上游caspase 蛋白酶的激活，抑制细胞的凋亡［19］。Bax 蛋白作为线粒体膜上离子通道的组成成分，使细胞色素C 得以穿过线粒体膜，激活Caspase-9，并进一步激活Caspase-3，导致细胞凋亡［20］。该Western blot结果显示，缺血再灌注损伤模型组Caspase-3阳性表达显著增高，Bax促凋亡基因表达增加，Bcl-2抗凋亡基因表达减少，Bcl-2/Bax比例减少，而预先加入原花青素可显著抑制Caspase-3阳性表达，Bax促凋亡基因表达减少，Bcl-2抗凋亡基因表达增加，Bcl-2/Bax比例增加，呈剂量依赖性。提示原花青素可通过上调Bcl-2及下调Caspase-3、Bax的表达，增加Bcl-2/Bax比例来发挥减轻缺血再灌注损伤诱导的心肌细胞凋亡，增加其存活率。

本研究结果还显示，不同剂量的原花青素均可显著降低血清CK-MB活性和心肌梗死面积。证明原花青素对缺血再灌注过程中心肌损伤有保护作用。我们通过TUNEL法检测心肌细胞凋亡显示，与正常组相比，模型组、原花青素低、高剂量组心肌细胞凋亡率明显高于正常组，证实了缺血/再灌注损伤可诱导心肌细胞凋亡发生。原花青素预处理低、高剂量组的心肌细胞凋亡率明显低于模型组，说明原花青素预处理有抑制缺血/再灌注损伤所致心肌细胞凋亡的作用。

综上所述，原花青素可以明显减少缺血再灌注后的心肌细胞凋亡，减轻再灌注损伤，可能与其抑制Caspase-3和Bax蛋白表达，增加Bcl-2蛋白表达，提高Bcl-2/Bax比例有关。本研究为原花青素能够减轻再灌注损伤提供了一定的实验依据，但应用于临床，仍需大量临床实验。

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（编辑：汪碧蓉）

Effects of Procyanidin on Myocardial Apoptosis and Related Protein Expressions in Experimental Rats With Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

LIU Dan， WANG Gao-pin， CHANG Qing-hua， LIU Yi.
Department of Cardiology， The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College， Jinzhou （121000）， Liaoning， China
Corresponding Author： WANG Gao-pin， Email： lijunchang0802@126.com

Ischemia reperfusion； Procyanidin； Apoptosis

121000 辽宁省锦州市，辽宁医学院附属第一医院 心内科（刘丹、王高频、常清华）； 辽宁医学院药理学教研室（刘义）

刘丹 主管护师 硕士 研究方向为冠心病的诊治 Email： lijunchang0802@126.com 通讯作者：王高频 Email： lijunchang0802@126.com

R542

A

1000-3614（2016）07-0696-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2016.07.018

（2015-08-14）