福建地区269对同型地中海贫血基因携带者夫妇产前基因诊断结果分析

林 娜 黄海龙 王 燕 王林铄 李 英 郭丹华 何德钦 徐两蒲 林 元

福建省妇幼保健院产前诊断中心，福建省产前诊断与出生缺陷重点实验室(福州，350001)

·临床研究·

福建地区269对同型地中海贫血基因携带者夫妇产前基因诊断结果分析

林 娜 黄海龙 王 燕 王林铄 李 英 郭丹华 何德钦 徐两蒲 林 元*

福建省妇幼保健院产前诊断中心，福建省产前诊断与出生缺陷重点实验室(福州，350001)

目的：了解同型地中海贫血(简称地贫)基因携带者夫妇胎儿基因诊断情况，为遗传咨询提供依据。方法: 2008年5月～2014年12月在本院确诊均为同型地贫基因携带者夫妇269对(同为α地贫基因携带者177对，同为β地贫基因携带者87对，其中一方为复合α、β地贫携带者5对)，通过胎儿绒毛、羊水、脐血获取胎儿标本提取DNA，应用Gap-PCR和PCR结合反向斑点杂交技术等方法进行α、β地贫基因诊断，胎儿标本同时行染色体核型分析。产前诊断后1年随访妊娠结局。结果: 177对α地贫基因携带者夫妇产前基因诊断结果为46例(26.0%)正常；68例(38.4%)杂合子；63例(35.7%)严重型地贫基因，其中55例巴氏水肿胎(51例东南亚缺失型纯合子，4例少见泰国缺失型α地贫1和东南亚型双重杂合子)，8例HbH病。87对β地贫基因携带者夫妇产前基因诊断结果为23例(26.4%)正常；39例(44.8%)杂合子；25例(28.7%)严重型地贫基因，其中9例纯合子及16例双重杂合子。5对一方为复合α、β地贫携带者夫妇中产前基因诊断结果正常1例，地贫杂合子2例，α、β复合地贫1例，β地贫双重杂合子1例。266例胎儿细胞染色体核型分析正常，3例胎儿核型异常，分别为21三体1例、13三体1例、45，X1例。63例严重类型α地贫胎儿、26例严重类型β地贫胎儿、3例染色体异常胎儿均在孕期引产。结论: 同型地贫基因携带者夫妇胎儿基因诊断可检出Hb Bart’s胎儿水肿综合征、Hb H病等重中型α地贫胎儿，以及β地贫纯合子、双重杂合子重型β地贫胎儿，应重视罕见突变基因型的检测，检测地贫基因同时应行染色体检查以排除染色体病。

地中海贫血；基因型；产前诊断；核型分析

α和β型地中海贫血(简称地贫)是人群中最常见的地贫类型，我国南方省份如广西、广东、福建为地贫高发区[1]。由于目前缺乏对重型地贫的有效治疗方法，因此，夫妇双方为同型地贫基因携带者在妊娠早期或中期进行产前诊断，阻止重型地贫儿出生，是最积极有效的预防措施。笔者对夫妇双方为同型地贫携带者孕妇进行产前基因诊断，同时进行细胞遗传学分析，并随访妊娠结局，为遗传咨询提供参考。

1 对象与方法

1.1 对象

2008年5月～2014年12月，在本院产前诊断中心确诊为同型地贫携带者的夫妇269对，在签署知情同意书后行产前基因诊断和染色体核型分析。269对夫妇中均为α地贫基因携带者177对，均为β地贫基因携带者87对，其中一方为复合α、β地贫基因携带者5对。

1.2 方法

1.2.1 标本采集和胎儿DNA的提取 根据孕周选择标本采集方式，共获得16例绒毛、195例羊水、58例脐带血标本。标本部分用于DNA的提取，其余部分用于细胞遗传学检查。DNA提取方法按地贫基因诊断试剂盒(深圳益生堂生物技术有限公司)说明书进行。

1.2.2 α珠蛋白基因检测 采用Gap-PCR方法诊断中国人常见的东南亚型(--SEA)基因缺失、-α3.7基因缺失和-α4.2基因缺失等3种缺失型α-地贫基因，采用反向斑点杂交法( PCR-RDB)检测常见的α-珠蛋白基因αCS、αQS和αWS3种点突变型地贫基因，检测方法按试剂盒(深圳益生堂生物技术有限公司)操作说明书进行。

1.2.3 β珠蛋白基因检测 采用PCR结合反向斑点杂交法(PCR-RDB)，检测中国人常见的β地贫基因17 种基因突变类型，检测方法按试剂盒(深圳益生堂生物技术有限公司)操作说明书进行。

1.2.4 泰国缺失型α地贫和Hkαα基因检测 --THAI/αα缺失型基因采用Gap-PCR技术分析，Hkαα采用单重PCR和巢式PCR进行，参照文献[2-3]方法进行。

1.2.5 胎儿细胞遗传检查 绒毛、羊水及脐血的培养、制片、G显带，通过GSL-120全自动染色体扫描平台进行核型采集和分析。每例计数20个核型，分析5个，如遇异常则增加计数和分析。

1.3 随访

269例孕妇均在产前诊断后1年电话随访，了解严重类型地贫胎儿结局、非严重类型地贫胎儿出生后表型和发育情况。

2 结果

2.1 同型地贫基因携带者夫妇产前基因诊断

269对同型地贫基因携带者夫妇产前诊断共检出63例(23.4%)严重类型α地贫胎儿(包括巴氏水肿胎和HbH病)、26例(9.7%)严重类型β地贫胎儿(包括突变纯合子及双重杂合子)，共89例(占33.1%)。见表1。

表1 269对同型地贫基因携带者夫妇产前诊断分析

2.2 夫妇同为α地贫基因携带者产前基因诊断

夫妇同为α地贫基因携带者177例孕妇中产前诊断检出3种常见α地贫缺失型基因(--SEA基因缺失、-α3.7基因缺失和-α4.2基因缺失)、3种非缺失型基因(αCS、αQS和αWS)、少见的泰国缺失型α-地贫1基因(--THAI)及香港型(HKαα)共8种突变基因类型。见表2。

表2 177对同型α地贫基因携带者 夫妇产前基因诊断分析

2.3 夫妇同为β地贫基因携带者产前基因诊断结果

87对同为β地贫基因携带者夫妇中产前基因诊断正常23例、杂合子39例、纯合子9例及双重杂合子16例。共检出6种常见β地贫基因类型，见表3。

2.4 同型地贫基因携带者夫妇中一方为复合α、β地贫基因携带者产前基因诊断

同型地贫基因夫妇中一方为复合α、β地贫基因携带者5对进行产前诊断，其中产前基因诊断正常基因型1例[母亲基因类型为-28(A→G)/N，父亲基因型为-28(A→G)/N合并--SEA/αα]；地贫杂合子2例，其中1例胎儿基因型为-α3.7/αα[母亲基因型为CD41-42(-TCTT)/N，父亲基因型为-28(A→G)/N合并-α3.7/αα]，另1例胎儿基因型为--SEA/αα[母亲基因型为IVS-2-654(C→T)/N合并--SEA/αα，父亲基因型为CD17(A→T)/N ]；1例复合α、β地贫[母亲基因型为CD27-28(+C)/N合并--SEA/αα，父亲基因型为-28(A→G)/N)]；1例β-地贫双重杂合子CD41-42/ CD17(A→T)[母亲基因型为CD41-42(-TCTT)/N合并--SEA/αα，父亲基因型为CD17(A→T)/N]。

表3 87对同为β地贫基因携带者 夫妇产前基因诊断分析

*N代表无突变

2.5 胎儿细胞遗传检查

269例产前诊断标本行细胞染色体核型分析，266例正常，3例羊水基因诊断结果虽然为α地贫杂合子，但染色体核型分析为21三体1例、13三体1例、45，X 1例。

2.6 随访

269例行产前诊断的孕妇未发生术后并发症，92例胎儿引产，包括51例东南亚型纯合子及4例泰国缺失型α地贫和东南亚型双重杂合子(--THAI/--SEA)；8例Hb H病；9例β地贫突变纯合子及17例β地贫双重杂合子；3例染色体核型异常。引产胎儿取脐带血行地贫基因诊断，与产前诊断结果一致。其余则选择继续妊娠，产前诊断1年后电话随访证实，胎儿出生后半年无重度贫血表型，发育情况正常。

3 讨论

福建地处东南沿海，是地贫高发区，2013年报道福建人群α和β地贫的发生率分别为3.17%和1.32%，总发生率达4.4%[4]。增加地贫产前筛查率，提高产前诊断检出率，降低漏诊率，减少误诊率，是目前防治地贫的主要目标。

本资料中同型地贫基因携带者夫妇269对中，产前基因诊断检出63例(23.4%)严重类型α地贫胎儿(包括巴氏水肿胎和HbH病)、26例(9.7%)严重类型β地贫胎儿(包括突变纯合子及双重杂合子)。提示高风险孕妇中间型、重型地贫的检出较高。因此重视筛查高危人群，并追踪和产前诊断可有效降低地贫患儿出生率。本资料中α地贫产前诊断以东南亚型为主，β地贫以IVS-2-654和CD41-42为主，这一结果与流行病学调查结果基本吻合[4]。

目前医院的地贫筛查模式通常以孕妇筛查为主(包括血常规和血红蛋白分析)，孕妇筛查异常时才对丈夫行地贫基因检测，这样容易漏诊。因为夫妇双方中女方为α-1地贫时，有典型的平均红细胞(MCV)体积下降，不会漏诊；而女方为α-2地贫基因携带者、男方为α地贫1基因携带者时，则由于α-2地贫基因携带者(轻型、静止型尤其是HbCS患者) MCV可以正常，血红蛋白分析缺乏特异性改变，容易漏诊。在本资料中就有55对夫妇一方是东南亚型，一方是α-2地贫基因携带者，其中9例胎儿基因诊断为Hb H病。故当一方已经确诊为地贫基因携带者，另外一方必须进行分子生物学检查。本资料中177对同型α地贫基因携带者夫妇产前诊断中发现55例巴氏水肿胎儿，其中51例为东南亚纯合子，另外4例泰国缺失型α地贫1和东南亚缺失型双重杂合子胎儿，超声检查也表现为水肿综合征。泰国缺失型α地贫1仅在我国广东、广西、台湾、福建等地区有报道[5-8]，而且这种罕见的地贫类型基因检测不是常规的筛检项目。本资料中有4对就属于这种情况，一方为东南亚型，但另一方未检出常见缺失类型，若没有进一步行罕见泰国缺失型α地贫1基因型的诊断，很容易漏诊。临床上针对那些有不明原因水肿胎儿生育史的夫妇，应考虑可能是少见的泰国缺失型α地贫引起的非免疫性胎儿水肿。本资料中1例罕见基因型HKαα/--SEA，其地贫临床症状要明显轻于缺失型Hb H病-α3.7/ --SEA。而HKαα/--SEA与--SEA/αα基因型胎儿，出生时HbBart's水平都在一定的范围，无明显的血液学和临床区别。此胎儿父亲基因常规检测为-α3.7/αα，母亲为--SEA/αα，胎儿α2、-α3.7、--SEA3种条带同时出现,最终发现父亲实际为HKαα/αα。目前商品化的α地贫检测试剂盒只针对中国人常见的3种缺失和3种突变类型，不能检测出泰国缺失型α地贫1及HKαα等，极易发生漏诊，临床医生应加强认识，对可疑者，应补充罕见型地贫基因检测，避免漏诊。

绝大多数β地贫患者表现为典型的小细胞低色素贫血、HbA2增高，不易漏诊；β地贫的表征会掩盖α地贫的表征，对于双重地贫携带者，胎儿需做α和β两种地贫的基因诊断，以避免漏诊。

目前产前诊断方法取材主要来自绒毛、羊水和脐血，在对269对同型地贫基因携带者夫妇进行产前地贫基因诊断的同时进行胎儿染色体核型分析，发现有3例羊水培养染色体核型异常而终止妊娠。因此在地贫产前诊断的同时，也应行染色体检查，排除常见染色体病，避免引起医疗纠纷。

中国南方部分地区由于较高的地贫基因携带率应该开展前瞻性的地贫筛查和产前诊断工作，即夫妇孕前同时进行地贫筛查；应重视复合型地贫的基因诊断；注意检测有无罕见类型地贫；地贫产前基因检测应同时检测有无染色体病。通过对高危者进行产前基因诊断，可以防止重型地贫儿的出生及不良妊娠结局的发生，从而提高出生人口素质。

[1] 杜传书. 地中海贫血研究的现状与未来[J]. 中华医学遗传学杂志，1996，13(5):257-259.

[2] Chong SS, Boehm CD, Cutting GR, et al. Simplified multiplex-PCR diagnosis of common southeast asian deletional determinants of alpha-thalassemia[J]. Clin Chem, 2000, 46(10): 1692-1695.

[3] Wang W，Chan AY，Chan LC，et a1.Unusual rearrangement of the alpha-globin gene cluster containing both the -α3.7and αααanti4.2crossover junctions：clinical diagnostic implications and possible mechanisms[J]. Clin Chem, 2005，5l(11)：2167-2170．

[4] 徐两蒲, 黄海龙, 王燕, 等. 福建省籍各地市人群地中海贫血的分子流行病学研究[J].中华医学遗传学杂志, 2013，30(4):403-406.

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[责任编辑：张 璐]

Analysis of prenatal gene diagnosis results of the 269 couples with the same type of thalassemia in Fujian provine

LIN Na, HUANG Hailong, WANG Yan, WANG Linshuo, LI Ying, GUO Danhua, HE Deqing, XU Liangpu, LIN Yuan*

CenterofPrenatalDiagnosis,FujianMaternityandChildrenHealthHospital，TeachingHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou，Fujian350001

Objective: To understand results of the prenatal gene diagnosis of the couples with the same thalassemia type. Method: From May 2008 to December 2014, 269 couples with the same thalassemia type from Fujian Maternity and Children Health Hospital were recruited, which including 177 α thalassemia couples ,87 βthalassemia couples, and among them , wife or husband of 5 couples wereαandβthalassemia. Genomic DNA was extracted from villus, amniotic fluid or cord blood from the fetuses. Gap polymerase chain reaction (gap PCR) and reverse dot blot (RDB) technology were used to detect the common α and β thalassemia mutations. Follow up visit were done a year after the fetuses were born. Results: In 177 α thalassemia couples after prenatal diagnosis , 46 cases were normal(26.0%), 68 cases were heterozygous (38.4%) , and 63 cases(36.0%) were severe thalassemia, which included 55 Bart's hydrops syndrome and 8 Hb H disease. In 87 β thalassemia couples after prenatal diagnosis , 23 cases were normal(26.4%), 39 cases were heterozygous (44.8%) , and 25 cases(28.7%) were severe thalassemia, which included 9 cases of homozygous and16 cases of heterozygous. 5 families with α and β thalassemia were found that baby with 1 severe thalassemia, 1 α and β thalassemia, 2 heterozygote and 1 normal infant. Among the cases, 266 cases of fetal cells karyotype analysis were normal and 3 cases of fetal cells karyotype analysis were not normal, which included one 13 trisomy, one 21 trisomy and one 45, X. 63 cases with severeαthalassemia, 26 cases with severeβ thalassemia and 3 cases with chromosomal abnormality were aborted. Conclusion: In couples with the same thalassemia type, Bart's hydrops syndrome, severeHb H disease, severeβthalassemia(homozygous or heterozygous) can be. Rare mutations detection should be paid attention to. To eliminated the chromosome disease, at the same time of thalassemia detected, chromosome check should be also detected

Thalassemia；Geneotype；Prenatal diagnosis；Karyotype analysis

福建省科技厅重大专项资助项目[2013YZ0002-1]；福建省临床重点专科建设资助项目[20121589]；福建省自然科学基金资助项目[2012J01311]；福建省卫生计生委医学创新课题资助项目[2012-CX-9]；福建省卫生计生委中青年骨干人才培养资助项目[2013-ZQN-ZD-6]

2016-03-23

2016-05-10

*通讯作者：alice-96@163.com

10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.06

*Corrrespondingauthor：LINYuan,Email：alice-96@163.com