北美海棠组培快繁研究

黄俊轩++刘艳军++杨静慧++李建科++李雕

摘 要：为了建立北美海棠组培快繁体系，以北美海棠一年生休眠枝条为外植体，经过体外消毒后，将带有腋芽的茎段接种到1/2MS培养基上进行无菌苗的培养，然后剪取带有腋芽的北美海棠无菌苗的茎段接种到含有不同激素浓度的MS培养基上进行再生芽的增殖培养，从中筛选出增殖效果最好的培养基配方组合，之后将再生出的小芽的外植体接种到含有不同激素的伸长生长培养基上进行培养，从中筛选出伸长效果最好的培养基配方，之后待到伸长培养的小苗长到5 cm时，将其从外植体上剪下接种到含有不同生长素的生根培养上进行生根培养，从中筛选出最适的培养基配方。经过不同阶段的培养，试验结果显示：增殖效果最好的培养基配方为MS+1.5 BA+0.5 IAA+30 g·L-1蔗糖；伸长效果最好的培养基为MS+0.5 BA+1.0 IAA+30 g·L-1蔗糖；生根效果最好的为1/2 MS+0. 5 NAA+20 g·L-1蔗糖。本试验结果将会应用在北美海棠优质苗木的快繁及育种研究中。

关键词：培养基；激素；增殖培养；分化

中图分类号：S661.4 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.08.006

Abstract： In order to build the rapid propagation system of American Begonia， the annual dormant branches of American Begonia were taking as explants in this test. After disinfection in vitro， stem segment with axillary bud was inoculated onto the 1/2 MS medium for sterile seedling cultivation. Then the bud stem section of American Begonia was inoculated onto the MS medium containing different concentration hormones for bud multiplication culture， and to screen the best medium formula for proliferation. Then the explants with regenerated buds were inoculated onto the MS medium containing different concentration hormones for buds elongation， and to screen the best medium formula for elongation. When the seedlings for elongation were 5 cm long， they were cut off from the explant and inoculated onto the MS medium containing different concentration auxins for rooting culture， and to screen the best medium formula for rooting. Through the cultivation of different stages， the research results showed that the best culture medium formula for proliferation was MS+1.5 BA+0.5 IAA+30 g·L-1 sucrose. The best medium for elongation was MS+0.5 BA+1.0 IAA+30 g·L-1 sucrose； for the best medium for rooting was 1/2 MS+0.5 NAA+20 g·L-1sucrose. The test results will be applied in American Begonia fast propagation and breeding study.

Key words： medium； hormone； multiplication culture； differentiation

北美海棠，学名North Americart Begonia，为蔷薇科苹果属落叶乔木，它是由美国和加拿大的育种者从自然杂交的海棠中选育出来的，已经在北美种植和推广了几十年，因此被称作北美海棠。北美海棠具有很高的观赏价值，不但其花和果实的色彩丰富，而且许多品种的叶色和枝条亦随着季节的不同呈现出不同的色彩。另外，北美海棠抗性强，耐寒，耐瘠薄，管理容易，观赏效果好。北美海棠现已成为北方气候条件下被广泛应用的一种重要的园林植物。随着我国对园林业的大力发展和扶植，市场需要越来越多的优质绿化苗木，北美海棠已经成为优良的绿化资源，并逐渐成为苗木市场的主推品种[1]。在园林绿化中适于列植于道路两旁，亦可孤植、丛植于草坪上或点缀于岩石旁、湖水边[2]。

现在园林中应用的主要北美海棠品种有：道格、红丽、宝石、凯尔斯、粉芽、红玉、王族、火焰、雪球、钻石、绚丽、草莓果冻等。其中“凯尔斯”为重瓣花的新品种，“红玉”海棠为垂枝的品种，“王族”海棠叶色紫红，是观花观叶的优秀品种。这些海棠的花期为4月下旬，花色极为丰富，主要体现在白色、粉色、紫色、红色等色系中，有不同色深及冷暖色调差异 [3]。

北美海棠作为重要的园林绿化植物新品种，关于它的繁殖方法报道较多。其中多数是关于嫁接与扦插进行繁殖的[4-6]。虽然扦插或嫁接的繁殖方法简便易行，但受到季节限制及成活率等因素的影响，在生产上很难保证向市场提供充足的北美海棠苗木。另外，采用传统繁殖方法还会造成繁殖苗木病虫害的大范围传播，不能提供优质的繁殖苗木。随着现代生物技术的发展，尤其是组织培养技术的广泛应用，一些绿化用苗木已经开始采用组培繁殖技术进行繁殖，并逐渐取代传统的嫁接与扦插繁殖方法[7-9]。与后者相比，组培繁殖具有以下优势：一是繁殖系数高，组培不受季节限制，可以周年生产，同时增殖系数高，繁殖系数相应提高；二是苗木质量优，因为可以通过组培繁殖过程去除母株所带的病虫害，得到健壮的繁殖苗木；三是成活率高，节约生产成本。传统繁殖方法在后期苗木培养过程中经常会由于苗木质量差，管理繁琐等因素的影响造成成苗率显著下降的现象，因此，会导致生产成本的增加，尤其是大苗的高死亡率更是严重影响了苗木的种植与推广。而组培苗越到生长后期，生长势越强，这就保障了苗木的成苗率与成材率。

近年来，关于北美海棠组培快繁的报道越来越多[10-11]，虽然北美海棠的组培研究相对较为简单，也很容易获得再生苗，但多数增殖效率并不理想，许多品种还不能做到工厂化生产，因此，本研究主要针对北美海棠组培中这一问题，通过组培中影响其快繁效果的各种因素进行优化试验，目的就是要建立一套高效的北美海棠组培快繁体系，实现北美海棠试管苗的工厂化生产，为生产上提高充足的组培苗木。

1 材料和方法

1.1 试验材料

北美海棠一年生枝条取自天津农学院园林植物教研室实习基地。

1.2 试验方法

1.2.1 北美海棠外植体消毒处理 选取生长健壮、无病虫害的北美海棠一年生枝条，选取时间应在落叶1个月后。在实验室中用自来水将枝条表面反复冲洗干净，在超净工作台中进行外植体的表面消毒处理。具体操作步骤为：先用70%的酒精将带有休眠芽的枝条切断浸泡30 s，然后采用40%的安替福民水溶液进行消毒处理10 min，然后用无菌水进行冲洗3～5次。将洗净消毒剂的外植体用无菌的滤纸吸干表面水分，然后将其接种到含有10 mg·L-1 GA3的1/2MS培养基上，在温度为25 ℃，24 h光照下进行休眠芽的萌发培养。

1.2.2 北美海棠的增殖培养 当北美海棠茎段外植体的休眠芽萌发并长到2～3 cm时，将其从外植体上切下，转移到含有不同生长激素的培养基上进行再生芽的增殖培养。增殖培养采用容积为100 mL的广口三角瓶，其中加入35 mL的固体培养基。每个处理做8瓶，每瓶接种5个萌发的腋芽。培养条件为25 ℃，24 h光照。经过40 d的培养，统计每种处理腋芽的增殖情况。

1.2.3 北美海棠的伸长培养 当增殖培养的北美海棠芽长到2～3 cm时，在超净工作台中将其从芽丛中分离开来，每个单独的芽分别接种到含有不同激素的MS培养基上，进行再生芽的伸长培养，试验条件同前。每个处理接种8～10个再生芽，并重复5次，经过30 d的培养，统计每个处理再生芽的伸长情况。

1.2.4 北美海棠的生根培养 当伸长培养的北美海棠苗长到5 cm时，将其转移到含有不同生长素的培养基上进行再生苗的生根培养。其中每个三角瓶接种5～8个再生苗，并重复5次。培养条件与前面相同。经过30 d后统计北美海棠再生苗的生根情况。

2 结果与分析

2.1 北美海棠的腋芽增殖结果

北美海棠休眠芽在含有GA3的培养基上经过30 d的培养后，腋芽萌发并正常生长。当腋芽长到2～3 cm时将其切下转接到增殖培养基上进行培养，经过40 d的培养，从腋芽的顶点分生出一定数量的丛生芽，每个处理情况不同，通过对增殖芽数量与生长情况的统计，记录整理形成表1。

从表1中可以看到，在采用不同分裂素情况下，北美海棠增殖情况明显不同。从增殖系数来看，采用BA作为分裂素获得的增殖系数明显高于KT，且从再生芽生长情况来看，采用BA诱导出的再生芽生长基本健壮，只有BA达到2 mg·L-1时才生长缓慢；相反，采用KT为分裂素，增殖系数明显低于BA，并且再生芽生长缓慢，且出现玻璃化显现，说明KT不利于北美海棠的增殖培养。在采用BA为分裂素时，随着其浓度的增加，增殖系数逐渐增大，但当BA浓度达到2 mg·L-1时，再生芽的生长速度下降，同时增殖系数也降低，说明在适宜的BA作用下北美海棠的增殖效果最好。综上情况，采用MS+1.5 BA+0.5 IAA+30 g·L-1蔗糖的培养基最适于北美海棠增殖培养。

2.2 北美海棠的伸长培养结果

将增殖培养中长出的再生芽剪下，接种到含有不同激素的培养基上进行伸长培养，经过大约30 d的培养，再生芽开始伸长，试验结果见表2。

从表2中可以看到，不同激素组合对北美海棠分化的影响不同。其影响变化主要决定于分裂素与生长素的比例，当分裂素/生长素的比值较高时，再生芽仍然保持分化状态，并有新的再生苗长出，而原来的再生芽也不再伸长。如果继续延长培养时间则会造成再生芽玻璃化并褐变死亡，不能得到生长健壮的再生苗。相反，当其比例降低时，即采用较高的生长素时，分化现象受到抑制，而出现再生苗迅速伸长生长现象。从表2可以看到，适宜的分裂素/生长素的比值可以获得较好的再生苗伸长效果，结合再生苗的生长于伸长情况，在MS+0.5 BA+1.0 IAA的培养基上获得的北美海棠伸长效果最好。

2.3 北美海棠的生根试验结果

待伸长培养的北美海棠苗长到5 cm左右时，在超净台中将其剪下，接种到含有生根培养基的三角瓶中。经过大约一周的时间，在组培苗的基部就有根出现，经过30 d的培养，在每种培养基的瓶中，生根情况出现明显的不同，具体情况见表3。

北美海棠属于木本植物，组培生根较困难，因此，笔者采用较低渗透压的1/2 MS作为基本培养基，同时附加20 g·L-1的蔗糖。从表3中的数据可以看出：

首先，不同生长素对北美海棠的生根影响不同，IAA虽然能够使得组培苗生根，但从数量与根长来看多表现为较低的数值，而且从生根的质量上看，在IAA培养基上诱导出的根都是短粗的肉质根。这种根基本不具备根的基本功能，除了具有被动的吸收之外，不具有真正根的任何生理机能，因此，即使进行带根移栽，这样的组培苗一般都不能成活。因此，这类生根没有实际意义。这一现象说明，北美海棠组培苗对IAA表现不好，相反，采用NAA则可以获得生长正常、健壮的根，而且数量和根长都十分理想，因此，NAA适宜作为诱导北美海棠组培苗生根的激素。

其次，在采用NAA进行诱导生根时可以见到，随着NAA使用浓度的增加，可以诱导出数量较多的再生根，但当NAA的浓度达到1.0 mg·L-1时，生根质量出现明显变化，根的长度减小，并且粗度变细，呈现出簇生状态。这种根也与IAA诱导出的肉质根相似，移栽时容易造成组培苗根的伤害，从而造成微生物感染，导致移栽成活率下降，因此，在生产上不采用这类生根苗进行移栽。

综上情况，在北美海棠生根试验中，采用1/2 MS+0. 5 NAA+20 g·L-1蔗糖的培养基可以获得理想的生根苗。

3 讨 论

3.1 不同分裂素对北美海棠增殖的影响

在本试验中，笔者采用了2种分裂素，即BA与KT。从试验结果可以看出，BA明显优于KT，这说明北美海棠的增殖更适于BA。一般在诱导增殖的组培研究中，分裂素是必需的，因为组织的分化与生长是一定的分裂素与生长素共同作用的结果，当分裂素较高时，更利于组织分化，如增殖生长。相反，如果生长素较高则利于组织的增大生长，表现出组培材料生长速度加快。虽然如此，但每种植物对分裂素的选择是不同的。当采用某一分裂素进行诱导增殖培养时，如果通过改变其浓度不能收到理想的结果时，一般要考虑更换新的分裂素。因为植物对分裂素的种类是有所选择的，所以在木本植物进行增殖培养时，一般采用KT，而草本植物多采用BA。在本试验中结果正好相反，因此，这一规律也并不适于所有物种。因此，在进行植物增殖培养研究中，具体采用哪种分裂素还是以试验结果为准。

3.2 组培快繁中增殖率对繁殖效率的影响

在进行组培快繁研究中，影响繁殖系数的主要指标就是增殖率，即增殖系数。一般认为增殖率越高，繁殖效率也就相应增高，但在实际生产中这一原则也是不准确的。具体原因主要有以下几方面。第一，过高的增殖率会影响增殖芽的质量。由于增殖系数过高，再生芽的数量太大，势必造成其生长缓慢，且由于营养竞争，实际上许多再生芽在生长过程中会被淘汰，只有少量存活下来，反而降低了增殖率。同时生长过慢，也最终影响繁殖效率；第二，如果只求较高的增殖率，也会需要高浓度的分裂素，如果分裂素过高，就会造成其对植物的毒害作用，比较明显的现象就是会造成组培苗产生玻璃化，因此，即使增殖系数再高，但再生芽的质量很差，一样会导致实际的繁殖效果降低。因此，要在不造成再生芽伤害的前提下，适当增加分裂素的用量，以此增加其增殖率，才能收到理想的快繁效果；第三，过高的增殖系数会导致再生芽个体较小，在进行切分操作中会对再生芽造成较大的伤害，导致再生苗在转移过程中影响其以后的生长速度，甚至造成死亡，因此，在实际生产中也不会使得快繁效率增加。综上几个原因，在进行植物组培快繁研究中，在追求增殖率的同时也要考虑再生芽的质量，适宜的增殖系数是实现组培快繁效率的关键。

3.3 渗透压对生根的影响

渗透压对于组培苗生根很重要，因为植物生根需要较低的渗透压，低渗透压利于根原基的形成及根的快速伸长。在本试验中，采用1/2 MS，降低培养基中离子强度，从而使得培养基的渗透压降低，同时又采用了20 g·L-1的蔗糖，这也是降低渗透压的一种做法。虽然降低渗透压利于生根培养，但也应考虑组培苗的实际情况。首先，过低的渗透压是牺牲培养基中的营养成分（如无机盐或糖）换来的，因此，势必造成组培苗从培养基中获取营养的水平下降，一旦营养不足就会导致生根的效率下降，造成生根数量和生长速度的下降，不但不能增加生根率，相反还影响了生根的效果。其次，要根据组培苗的实际生长情况决定是否采用低渗透压。在本试验中，北美海棠组培苗在进行生根时生长的十分健壮，即使培养基营养缺乏，其也可以借助自身的营养积累实现生根。相反，如果组培苗生长较弱，应尽量避免采用低营养的培养基。因此，在实际生产中一定要根据具体情况适当降低渗透压来提高组培苗的生根效率。

4 结 论

北美海棠是一种重要的园林植物品种，因此，组培快繁对于其应用与推广具有十分重要的意义。本试验对其快繁中的主要技术指标进行了研究，具体操作规程总结归纳如下。（1）外植体获取。取休眠枝条，采用40%的安替福民水溶液进行消毒处理10 min，无菌水冲洗后，接种到含有10 mg·L-1 GA3的1/2 MS培养基上诱导腋芽的萌发；（2）增殖培养。将无菌芽接种到MS+1.5 BA+0.5 IAA+30 g·L-1蔗糖的培养基进行增殖培养，经过40 d的培养获得再生芽；（3）伸长培养。将增殖培养长的再生芽剪下，接种到MS+0.5 BA+1.0 IAA+30 g·L-1蔗糖的培养基上，30 d后获得伸长的组培苗。（4）生根培养。将长到5 cm的组培苗接种到1/2 MS+0. 5 NAA+20 g·L-1蔗糖的培养基上，经过30 d的培养可以获得理想的生根苗。本试验结果对于北美海棠组培快繁意义重大，可以直接应用于北美海棠的工厂化育苗的生产。

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