快速检测农药残留技术的应用现状

冯俊宸,徐华能（.上海外国语大学附属外国语学校，上海 00083；.上海市农药研究所，上海 0003）

快速检测农药残留技术的应用现状

冯俊宸1,徐华能2
（1.上海外国语大学附属外国语学校，上海 200083；2.上海市农药研究所，上海 200032）

主要综述了目前广泛应用的农药残留检测技术酶抑制检测法、酶联免疫检测法、活体生物测定法、生物传感器法等快速测定方法的原理、优缺点。

农药残留；酶抑制；酶联免疫；活体生物测定；生物传感器；

农药在农业生产中的地位和作用不容置疑。如不使用农药，农作物的产量将减少1/3。但是由于部分使用者未规范、正确使用农药（如超范围或超剂量使用等），导致农产品中的农药品种及残留量超出安全标准，给食品带来了很大的安全隐患。当前我国政府正在不断加强食品安全（尤其是农产品的食品安全）保障工作，对农产品中的农药残留进行规范监测就是其中一项重要的措施。为此，农药残留检测技术的改进，检测技术的灵敏度和准确率的提高以及对快速检测分析新技术的开发与建立，已经显得日益迫切和十分重要。直接检测农药分子的常规农药残留分析方法，存在着样品前处理复杂，仪器设备昂贵，分析时间长等问题。这些方法已不能满足诸如大型农产品批发市场、超市等现场快速检测某些高毒农药的需求，促使人们运用新的原理和方法去开发特异性强、灵敏度高、方便快捷、结果确定的快速检测新技术。本文主要综述了目前广泛应用的酶联免疫分析方法、酶抑制法、活体生物测定方法和生物传感器法等快速测定方法的应用现状［1］。

1 酶联免疫分析法（ELISA）

1.1 原理

ELISA的核心技术是抗原抗体的特异性反应。ELISA的基本原理是将抗原抗体之间的特异性免疫反应和酶对底物的高度催化效应结合起来，以酶促反应的放大作用来显示初级免疫反应。它既可测抗原，也可测抗体［2］。

1.2 方法

EUSA需要固相载体作为吸附剂，用固相载体吸附抗体（抗原），加待测抗原（抗体），再与相应酶标记抗体（抗原）进行抗原抗体特异免疫反应，生成抗体（抗原）-待测抗原（抗体）-酶标记抗体（抗原）复合物，最后再与该酶底物发生反应生成有色产物。待测抗原（抗体）的量与有色产物量成正比，因此可借吸光度值计算抗原（抗体）量。ELISA法既可进行定性测定，又可进行定量测定。在上述反应中，酶促反应只进行一次，而抗原一抗体免疫反应可进行一次或数次［3］。

1.3 应用

ELISA技术还可应用于食品中其他成分的测定，⑴ 抗营养素因子如大豆及其制品中的胰蛋白酶抑制因子；⑵ 食品营养成分如牛初乳中乳铁蛋白含量等；⑶ 食品加工过程中的酶的含量变化；⑷ 检测某些特定的转基因表达蛋白，以分析食品是否来自转基因生物或者含有转基因成分［4］。

1.4 影响因素

影响因素一般涉及到样本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果判断、结果报告和解释等方面［5］。

1.5 前景

免疫分析法以其固有的优势，在农药残留分析中日益显示出强大的应用前景。其中以EUSA技术最活跃，EUSA具有特异性强、灵敏度高、快速、简便、痕量检测，以及可大批量样本检测的优点，其检测限可达到纳克甚至更低浓度。到现在为止，国际上已有上百种农药可用免疫分析法检测，且已制成商品化快速检测试剂盒或试剂条。目前我国已研制出6种农药残留酶联免疫检测试剂盒（甲霜灵、甲胺磷、毒死蜱、对硫磷、2,4-滴、百菌清），胶体金免疫快速检测试纸16种（3,5,6一三氯二吡啶醇、苯菌灵、除草定、丁草胺、毒死蜱、禾草灵、甲草胺、甲萘威、甲霜灵、霜霉威、西玛津、溴苯腈、乙草胺、异丙草胺、异丙甲草胺、莠去津）。另外研制出高效快速检测生物毒素的免疫检测试剂盒13种和免疫胶体金纸条5种；研制出兽药残留酶联免疫检测试剂盒11种，其中有些试剂盒已实现产业化，取得了显著的经济效益和社会效益。与国外相比，国内在这方面的研究相对较少，但正越来越受到研究检测工作者的高度重视。目前研发各种农药残留检测试剂盒的步伐日益加快，所以ELISA法在农药残留检测中将有广阔的应用前景［6］。

抗体特异性及灵敏性虽有较大程度提高，但仍不能同时检测数10种甚至更多农药残留。用于食品农药残留检测，在检测单个农药时具有快速、方便等优点。但由于农药品种繁多及混配使用等原因，在检测大批样品时，仍显得无能为力［6］。

2 酶抑制法

酶抑制法是一种简便、灵敏、经济的快速检测方法，是相对成熟的一种速测部分农药残留技术。它基于有机磷农药对酶活性的抑制作用，适用于有机磷和氨基甲酸酯类农药。在目前条件下，酶抑制法是净化蔬菜市场的一种有效可行的方法，其优点是能对抑制胆碱酯酶的农药品种进行快速灵敏的检测，样品前处理简单，检测时间短，所需仪器设备简单，适用于现场测定。缺点是使用的酶基质和显色剂有一定的特异性，需控制的条件较多［2］。

2.1 影响因素

2.1.1 温度和pH对酶促反应的影响

酶的活性都随着温度的升高先升高后降低［5］。

2.1.2 时间对酶促反应的影响［5］

随反应时间延长，反应速度下降。酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。

2.1.3 温度对农药抑制作用的影响

在一定的温度范围内（25～45 ℃）植物酯酶和乙酰胆碱酯酶受到农药的抑制作用都是随着温度的升高而增强［5］。

2.2.4 时间对农药抑制作用的影响

抑制时间越长，农药的抑制作用越强［5］。

2.2 分类

酶抑制法根据所使用的酶的种类不同可大致分为2类：胆碱酯酶法和植物酯酶法。

2.2.1 胆碱酯酶法

2.2.1.1 原理

乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制法的检测原理以乙酰胆碱为底物，在AChE的作用下，乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，胆碱和二硫对硝基苯甲酸（DTNB）产生显色反应，使反应液呈黄色［2］。

2.2.1.2 特点

该法操作简单，测定所需的时间短，不需要贵重的仪器，费用较低，适合于现场的快速检测。AChE抑制法虽然在回收率和精密度上较经典方法差一些，但可以满足半定量的要求，适合于我国小规模分散式的农产品生产与经销体系。另外，各种农药因其化学结构和作用机理不同对AChE的抑制能力也不相同，氧化型有机磷的抑制能力较强，AChE抑制法对其的灵敏度较高，最小检出浓度较低；而硫代型有机磷的抑制能力较差，最小检出浓度较高；但辛硫磷因为含有肟基，选择毒力大大增强，最小检出浓度较低；对氨基甲酸酯类农药的检测灵敏度相对都较高［4］。

2.2.2 植物酶抑制法

2.2.2.1 原理

植物酯酶水解2,6-二氯乙酰靛酚，水解产物靛酚为蓝色，最大吸收波长为605 nm。根据反应溶液在水解前后颜色的变化，用目测或仪器来判定农药对酶的抑制程度，从而判断有机磷或氨基甲酸酯类农药的残留量［2］。

2.2.2.2 特点

在利用酶抑制原理测定农药残留的方法中，植物酯酶与动物酯酶相比，抑制程度的各项指标均不逊色很多，同时又具有酶源方便易得，提取、保存方便，成本低等优势。但是目前的研究表明植物酯酶方法的精确度和灵敏度不及乙酰胆碱酯酶法，乙酰胆碱酯酶法的检出限数量级在0.001 mg/kg附近，而植物酯酶法只能在0.1 mg/kg附近，灵敏度较低［4］。

3 活体生物测定

3.1 原理

活体检测法是使用活的生物体直接测定。如农药与细菌作用后可影响细菌的发光强度，以检测农药残留量［2］。

3.2 方法

3.2.1 用发光细菌检测农药残留

发光细菌体内的荧光素在有氧时经荧光酶的作用会产生荧光，但当受到某些有毒化合物的作用时光会减弱，其减弱的程度与有毒物的浓度呈一定的线性关系。利用这一特点对农药残留试样进行测定。该方法的特点是快速、简便、灵敏、价廉，适合于现场，缺点是农药浓度与发光强度的线性关系不够准确，只能用于半定量测定［3］。

3.2.2 用家蝇检测蔬菜中的残留农药

以采收前1～2 d的蔬菜为检测对象，随机抽取检测样品，将家蝇放于菜汁中，接触后3～4 h观察死亡率，并且需要用无农药污染的蔬菜作为对照。死亡率在4%以下为安全或较安全；死亡率为5%～10%，蔬菜中农药残留量超标；死亡率大于11%，表示污染严重或极严重。该方法的优点是无需仪器，无需前处理，过程简单。缺点是无法定量，检测时间比较长，敏感性家蝇饲养比较困难［3］。

4 生物传感器法

生物传感器是将传感技术与农药免疫技术相结合而建立起来的，可以说它是免疫分析技术的一种延伸或分支。根据生物功能不同主要分为不同类型传感器，利用农药对靶酶活性的抑制作用研制传感器时，应选择活性高而其活性对农药敏感的酶作为生物传感器称为酶传感；利用农药与特异性抗体结合特性研制免疫传感器；另外还有微生物传感器和组织传感器等［3］。

4.1 原理

生物敏感膜内含有能与目标物进行选择性作用的生物活性组分；换能器则能敏感捕捉生物活性组分与目标物之间的作用过程，并将其表达为可检测的物理信号。当待测物与具有分子识别作用的利用特殊技术固定在换能器内（或表面）的生物活性因子作用时，产生光学、热学、压电学或电化学等响应信号，最后把所得的电信号经过电子技术的处理后，在仪器上显示或记录下来，其信号大小与分析物含量或浓度存在定量关系，从而实现对待测物质的定量检测［2］。

4.2 应用

Ngeh-Ngwainbi等最早研究成功了对硫磷的生物传感器，以后又有人制成了光导纤维免疫传感器，利用荧光标记抗体产生的反应，分析测定对硫磷在溶液中含量。生物传感器能广泛应用于基础研究、生物、临床化学和诊断、农业和畜牧兽医、化学分析、军事、过程控制与监测、环境监控与保护等领域。随着生物、化学、物理学、医学、电子技术等相关学科的迅速发展，生物传感器的发展也被带动，各种类型的生物传感器相继出现［4］。

生物传感器相对于酶免疫吸附测定法的优点是简单、快速且减少了样品的前处理。适于野外快速监测，减少有机溶剂使用量。虽然生物传感器在实验室条件下使用状态良好，但在实际中还没有广泛应用，其最大优点是稳定性、精确度和可信度高。它的缺点是一种传感器只能对应一种或一类农药，应用范围窄，研究过程长，不易制备［4］。

生物传感器是一门跨学科的高新技术，起步较晚，研制过程有诸多难点，在实际推广应用中还有许多待探索和改进的地方。⑴ 生物传感器寿命、稳定性及制备的复杂性制约着研究成果商品化与批量生产；⑵ 稳定性：由于生物单元的引入，生物结构固有的不稳定、易变性给生物传感器的应用带来不少困难［6］。

［1］曾小岚, 张歆, 付东亮, 等. 酶抑制法检测蔬菜中的有机磷农药［J］.环境监测管理与技术, 2004, 16（6）:12-14.

［2］邱静. 我国主要农药残留快速检测方法及产品现状分析［J］. 农产品质量与安全, 2011（5）: 41-46.

［3］谢艳姣, 吴荣顺, 苑婷婷. 农药残留快速检测技术研究进展［J］. 中国果菜, 2015（12）: 31-34.

［4］邓敏姬, 邓敏航, 郑琪, 等. 农药残留快速检测技术研究进展［J］. 广西热带农业, 2010（5）: 7-11.

［5］杨靓, 刘小娟, 郭玉双. 农药残留快速检测技术研究进展［J］. 黑龙江农业科学, 2012（10）: 150-153.

［6］王亮, 潘琇, 徐婉莉, 等.食品农药残留快速检测技术研究进展［J］.温州农业科技, 2005（10）: 10-12.

Research of Rapid Detection of Pesticide Residue Technology

FENG Jun-cheng, XU Hua-neng
（1.Shanghai Foreign Language School Affiliated SISU, Shanghai 200083, China; 2.Shanghai Pestcide Research Institute, Shanghai 200032, China）

The detection techniques of the pesticide residues currently widely used are the enzyme-linked immunosorbent assay, enzyme inhibition assay, in vivo bioassay and biological sensors. The paper introduces the principles, advantages and weaknesses and progress of those rapid determination methods.

pesticide residues; enzyme-linked immunosorbent assay; enzyme inhibitor; vivo bioassay; biological sensors

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2016.02.07

TQ450

A

1009-6485（2016）02-026-04

冯俊宸（1999—），男，上海人，参与开发了“Pesticide Kille”农残快速检测试剂盒，取得SAGE 2015中国区第3名。

徐华能（1979—），男，上海人，高级工程师，主要从事农药标准物质的研制工作。E-mail: xuhuaneng@cnshspl.com。

2016-03-20。