阿维A对HaCaT细胞表达AQP3 mRNA的影响及增液汤含药血清的调节作用

王红梅，刘琳，林书祥，王维（.天津市中医药研究院附属医院，天津 000；.山西省晋城市人民医院，晋城 048000；.天津市儿童医院，天津 004）

阿维A对HaCaT细胞表达AQP3 mRNA的影响及增液汤含药血清的调节作用

王红梅1，刘琳2，林书祥3，王维3
（1.天津市中医药研究院附属医院，天津 300120；2.山西省晋城市人民医院，晋城 048000；3.天津市儿童医院，天津 300134）

目的观察阿维A对HaCaT细胞表达水通道蛋白3（AQP3）mRNA的影响及增液汤含药血清的调节作用。方法应用不同浓度阿维A及增液汤干预HaCaT细胞，荧光定量反转录酶-聚合酶链反应（Reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）测定HaCaT细胞AQP3 mRNA的表达。结果阿维A溶液干预下的HaCaT细胞AQP3 mRNA表达下降，呈剂量依赖性；增液汤含药血清干预下HaCaT细胞AQP3 mRNA的表达上升，呈剂量依赖性；HaCaT细胞在增液汤含药血清与阿维A共同干预下的AQP3 mRNA表达水平高于同等浓度阿维A溶液干预的表达。结论阿维A溶液下调HaCaT细胞AQP3 mRNA表达，增液汤含药血清可以抑制这种下调作用。

阿维A；增液汤；水通道蛋白3，HaCaT细胞

随着阿维A应用到临床治疗银屑病，其不良反应也逐渐显现出来，主要不良反应是皮肤黏膜的干燥，发生率将近100%。皮肤干燥带来的瘙痒、皲裂不仅降低了患者的生存质量，而且增加了皮肤黏膜潜在感染的危险，所以有效缓解阿维A带来的皮肤黏膜干燥损害，将是增加阿维A安全应用的一个关键。

研究发现，AQP3 mRNA作为存在于皮肤的一种能快速转运水的膜整合蛋白，其高表达可以提高表皮水份的输送及增强皮肤的保水能力，缓解皮肤干燥。临床应用发现中医滋阴润燥的经典方剂“增液汤”对于缓解阿维A引起的皮肤干燥有良好的缓解作用，在此我们观察增液汤对阿维A引起的HaCaT细胞的AQP3mRNA表达的影响，从而探讨增液汤治疗皮肤干燥的机制，为该方的推广应用奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株、大鼠人永生化角质形成细胞系HaCaT细胞株（GDC106HaCaT），SD大鼠［合格证号SCXK（京）2002－0003］。

1.1.2主要试剂阿维A胶囊（重庆华邦药业），中药饮片购自天津市中医药研究院附属医院百草堂药房，二甲基亚矾（美国Sigma），细胞培养液和胎牛血清（Hyelonegongsi），TRIzol Reagent（Invitrogen公司），cDNA第一链合成试剂盒、RealMasterMix新型荧光定量PCR试剂盒（天根生化科技有限公司）。

1.1.3主要设备仪器超净工作台（CJT-16）（蚌埠净化设备厂），二氧化碳恒温培养箱（311）（Thermo Forma），相差倒置显微镜（IX71）（日本OLympus公司），冰冻离心机（5180R）（Eppendorf），荧光定量PCR仪（GR-3000）（澳大利亚南Corbett Research）。

1.1.4引物序列GAPDH，扩增产物313 bP；上游引物：5′-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3′；下游引物：5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′。AQP3，扩增产物 226 bp：上游引物：5′-AGACAGCCC CTTVAGGATTT-3′；下游引物：5′-TCCCTTGCCC TGAATATCTC-3′。

1.2实验步骤

1.2.1含药血清的制备

1.2.1.1SD大鼠雄性，200～220 g，室温22℃，相对湿度60%，常规喂养，禁食不禁水24 h后称质量，按人与动物体表面积折算等效剂量比值表计算每日灌胃药量，每日上午9∶00灌胃，灌胃7 d。

1.2.1.2灌胃药物的制备玄参30 g，麦冬24 g，生地24 g。制成含生药量2 g/mL的药液，灭菌后分装，密封4℃冰箱保存。

1.2.1.3含药血清的制备心脏取血，2 500 r/min，5 min离心后，取上清，用0.22 μm微孔滤膜过滤，-20℃保存。

1.2.1.4阿维A溶液的制备按分子质量计算，将阿维A胶囊溶于DMSO，制备成含10-5mmol/L阿维A浓度的溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-4℃冰箱保存备用。

1.2.2细胞培养HaCaT细胞生长于含10%小牛血清的DMEM高糖培养液中，37℃，CO2恒温培养箱静置培养。

1.3实验分组①空白对照组：不加入干预药物；②阿维A干预组：分别加入含10-5、10-6、10-7mol/L阿维A溶液培养24 h。③增液汤含药血清干预组：含3%、5%增液汤含药血清的培养液培养24 h。④空白血清干预组：含3%、5%空白血清的培养液培养24 h。⑤阿维A溶液与增液汤含药血清共同干预组：含10-5、10-6、10-7mol/L阿维A的培养液培养24 h后分别加入含5%增液汤含药血清的培养液。⑥阿维A溶液与空白血清共同干预组：含10-5、10-6、10-7mol/L阿维A的培养液培养24 h后分别加入含5%空白血清的培养液。

1.4MTT法检测药物干预对HaCaT细胞的增殖抑制作用。

1.5实时荧光定量反转录酶-聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）

1.5.1总RNA提取收集HaCaT细胞，向每管约5×106个细胞中加入0.5 mL Trizol总RNA提取试剂，轻轻吹打，室温静置5 min，使核酸蛋白复合物完全分解，加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡15 s，室温静置10 min，4℃，12 000 r/min，离心15 min，将上层水相移至新的EP管中，加入异丙醇，混匀，室温静置10min，4℃，12000r/min，离心15min，弃液，加入1mL 75%乙醇洗RNA 1次，4℃，12 000 r/min，离心5 min，弃液，重复1次。4℃，12 000 r/min，离心5 min，吸净残存液体，室温干燥。用0.1 mL DEPC水溶解RNA，55℃孵育10 min。取10 μL RNA溶液，加990 μL DEPC水稀释，在紫外分光光度计内测定RNA溶液在260 nm及280 nm处的光密度（OD）值。OD：60/ OD：50＞1.7时标本可用，否则重新提取。根据OD26值计算RNA浓度。

1.5.2逆转录在冰浴的无核酸酶的离心管中加入2μg总RNA，2μLRandom，2μLdNTP，补RNasefree水定容至13.5 μL。70℃加热5 min后迅速在冰上冷却2 min，瞬时离心收集反应液后加入4 μL 5× First-StrandBuffe，1 μL 0.1M DTT，0.5 μL RNasin。加1μLTIANScriptM-MLV混匀。25℃温浴10min，42℃温浴50 min，95℃加热5 min终止反应，RNase-free dd H2O将体系稀释至30 μL，-20℃冻存备用。

1.5.3RT-PCR反应20×SYBRsolution室温平衡并彻底混匀。将125 μL 20×SYBRsolution加入至1 mL 2.5×RealMasterMix中。在平头PCR管中分别加入2.5×RealMasterMix/20×SYRBsolution 9 μL，正向引物及负向引物各2 μL，逆转录产物2 μL，超纯水5 μL。反应体系为20 μL。在RG3 000定量PCR仪上按照RealMasterMix新型荧光定量PCR试剂盒说明书进行PCR反应：95℃起始变性2 min，94℃变性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸30 s。用双标准曲线法对AQP3基因进行相对定量测定。实验结果重复3次。

1.6统计学处理相应数据用SPSS12.0统计包进行分析，两样本均数比较用t检验，成组数据多样本均数比较用方差分析，组间比较采用SNK检验，以P＜0.05有统计学意义。不同药物处理后HaCaT细胞AQP3 mRNA表达的变化分析RT-PCR结果，以阴性组为基准，预设其AQP3 mRNA表达水平为1.0，采用单因素4水平设计定量资料的方差分析，显示组间总体来说差别有统计学意义（P＜0.01）。

2　结果

2.1MTT法检测药物干预对HaCaT细胞的增殖抑制作用①阿维A溶液对HaCaT细胞增殖有抑制作用，随着阿维A浓度的增加，对HaCaT细胞增殖的抑制作用明显增加，阿维A浓度10-6mmol/L、10-7mmol/L阿维A溶液对HaCaT细胞增殖的抑制作用较小（P＜0.05）。②增液汤含药血清对HaCaT细胞增殖没有明显的抑制作用（P＞0.05）。③空白血清对HaCaT细胞增殖没有明显的抑制作用（P＞0.05）④阿维A溶液与增液汤含药血清两者共同干预组对HaCaT细胞增殖的抑制作用与阿维A干预组一致，随着阿维A浓度的增大，抑制作用增强，阿维A浓度10-6mmol/L、10-7mmol/L阿维A溶液对HaCaT细胞增殖的抑制作用较小，阿维A溶液与增液汤含药血清两者共同干预组对HaCaT细胞的抑制作用较单纯阿维A干预较弱，但无明显差别（P＞0.05）。

2.2各组AQP3 mRNA的表达凝胶电泳图所示：条带在特异性范围内，且有亮度差异，基因测序符合AQP3。见图1。

图1 各组AQP3 mRNA表达凝胶电泳图

2.3RT-PCR结果各组HaCaT细胞AQP3 mRNA的表达，见表1。

阿维A溶液可下调HaCaT细胞AQP3 mRNA的表达，并随浓度的增大下调作用增强；增液汤含药血清上调HaCaT细胞AQP3 mRNA的表达，并随浓度的增大上调作用增强；增液汤含药血清干预阿维A干预过的HaCaT细胞，其表达AQP3 mRNA的水平高于同等浓度的阿维A溶液干预下的HaCaT细胞表达AQP3 mRNA的水平。

3　讨论

阿维A是用于治疗银屑病第二代维甲酸类药物，其临床效果得到广泛的认可，但在其临床应用过程中发生的不良反应——皮肤干燥引发脱屑、皲裂等现象及瘙痒、疼痛等不适感，不仅影响着患者的生存质量，而且皮肤的干燥脱屑，会造成角质层变薄，皮肤脂质分泌减少，皮肤屏障保护功能减退，往往会增加金黄色葡萄球菌的定植，增加了皮肤潜在感染的危险性；皮肤中的水含量是维持表皮结构的关键，正常含水量形成的渗透屏障是维持角质细胞增殖与分化的关键，当角质层水含量降到临界水平以下，正常脱屑所需酶的功能将受损，会使得角化细胞黏附堆积在皮肤表面，致使皮肤的干燥、粗糙、脱屑，皮肤屏障功能受损的恶性循环［1］。所以在阿维A的临床应用过程中有效地增加皮肤的含水量及脂质含量缓解皮肤的干燥不适成为提高阿维A临床应用的关键。

表1各组HaCaT细胞AQP3 mRNA的表达

水通道蛋白（AQP）是一类在细胞膜上与水分子通透性有关的转运蛋白，为一组小分子疏水性跨膜蛋白，可增加细胞膜的水通透性，在机体水平衡和内环境维持中发挥重要作用AQP一般选择性运输水分子，但少数AQP还可运输甘油、尿素等小分子物质，如AQP3。研究发现，AQP3基因敲除小鼠出现皮肤干燥、弹性降低、皮肤屏障功能修复及伤口愈合延迟，且选择性甘油水平减少和表皮保水能力降低［2］。作为干燥性皮肤病，AQP3也与银屑病相关，用免疫组织化学和免疫荧光染色等方法检测银屑病患者皮损和皮损周围皮肤，发现AQP3表达均显著低于对照组；与健康对照组相比，银屑病患者皮损和皮损周围皮肤中经表皮水丧失增多，皮肤含水量降低［3］。本次实验结果发现：阿维A可使HaCaT细胞表达AQP3 mRNA的水平下降，并随浓度的增大下调力量增强，说明阿维A治疗银屑病所致干燥等不良反应与AQP3的表达下降有关。

增液汤为中医滋阴润燥的经典方剂，由生地黄、麦冬、玄参3味药组成，在临床广泛应用于瘙痒症、干燥综合征等疾病，取得良好的临床效果，临床中我们应用增液汤与阿维A胶囊联合服用可以缓解服用阿维A患者皮肤黏膜的干燥不适；彭圆等［4］用免疫印迹法测定：口服增液汤可以提高大鼠皮肤AQP3蛋白水平的表达，润泽大鼠皮毛。笔者研究发现，增液汤含药血清有提高HaCaT细胞表达AQP3 mRNA的水平的作用，并随浓度的增大作用力增强，说明增液汤增强皮肤湿润性，缓解阿维A所致皮肤黏膜干燥。

本次研究发现：阿维A可使HaCaT细胞表达AQP3 mRNA的水平下降，并随浓度的增大下调力量增强；用增液汤含药血清干预阿维A干预过的

HaCaT细胞，其表达AQP3 mRNA的水平高于同等浓度的阿维A溶液干预下的HaCaT细胞表达AQP3 mRNA的水平。从理论上支持了在同服增液汤可以增加表皮细胞水通道蛋白3的表达，提高皮肤含水量及脂质含量，缓解皮肤干燥，减轻阿维A的不良反应，从而为更有效应用阿维A治疗银屑病提供有力的临床保障。

［1］Choi EH，Man MQ，Wang F，et al.Is endogenous glycerol a determinant of stratum corneum hydration in humans［J］.J Invest Dermatol，2006，126：1356.

［2］Hara M，Ma T，Verkman AS.Selectively reduced glycerol in skin of aquaporin-3-deficientmicemayaccountforimpairedskinhydration，elasticity，and barrier recovery［J］.J Biol Chem，2002，277：46616-46621.

［3］Voss KE，Bollag RJ，Fussell N，et al.Abnormal aquaporin-3 protein expression in hyperproliferative skin disorders［J］.Arch Dermatol Res，2011，303：591-600.

［4］彭圆，田黎明，张翀，等.增液行舟方药对津亏便秘衰老模型水通道蛋白表达的影响［J］.时珍国医国药，2014，25（11）：2611-2613.

Effect of Acitretin Solution on the Expression of AQP3 mRNA in HaCaT cells and the Regulation of Zengyetang Drug Serum to This Effect

Wang Hongmei1，Liu Lin2，Lin Shuxiang3，Wang Wei3
1.Tianjin Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital，Tianjin 3000120，China；2.the People's Hospital of Jincheng，Jincheng 048000，China；3.Tianjin Children's Hospital，Tianjin 300134，China

ObjectiveIn order to investigate the influence of acitretin solution on the expression of AQP3 mRNA in HaCaT cells and study the regulation of Zengyetang drug serum.MethodsWe used acitretin solution and Zengyetang drug serum in different concentration to treat HaCaT cells and adopted RT-PCR method to detect AQP3 mRNA of HaCaT cells.ResultsThe expression level of AQP3 mRNA in HaCaT cells treated with acitretin solution declined in a dose-dependent manner.The expression level of AQP3 mRNA in HaCaT cells treated with Zengyetang drug serum raised and also showed dose-dependence. The expression level of AQP3 mRNA HaCaT cells treated with both Zengyetang drug serum and acitretin solution was higher than that only treated with the same concentration of acitretin.ConclusionThe expression of AQP3 mRNA in HaCaT cells treated with acitretin solution declines.And this effect can be held up by Zengyetang drug serum.

Acitretin；Zengyetang；AQP3；HaCaTcells

R

A

1672－0709（2016）03-0151－04

王红梅，E-mail：yyy961030@163.com

2016-02-29）