油茶炭疽病病原菌生物学特性研究

王义勋　刘伟　郑露　陈京元　唐岚

摘要：对引起油茶炭疽病的胶孢炭疽菌的生物学特性进行了研究.结果表明，该病菌在10～35℃的温度范围内均能生长以及分生孢子正常萌发，其中30℃最适宜菌丝生长和分生孢子萌发；在pH3.0～11.0范围内菌丝均能生长和分生孢子均可萌发，pH6.0最利于菌丝生长，pH5.0～7.0最适宜分生孢子萌发。连续光照有利于菌丝的生长，光暗交替有利于分生孢子的萌发。可溶性淀粉和尿素利于菌丝生长；乳糖和麦芽糖与谷氨酸的不利于菌丝生长。甘露醇和甘氨酸有利于产孢，半乳糖和硝酸钾不利于产孢；菌丝和分生孢子的最低致死温度为55℃，10min。

关键词：油茶；胶孢炭疽菌；生物学特性

中图分类号：S435.659 文献标识码：A 文章编号：1004-3020（2016）03-0040-05

油茶Camelliae oleifera是我国南方林区重要的木本油料树种之一，适宜在荒山、丘陵区种植。其种子榨出的食用油（茶油）素有“东方橄榄油”美誉，不仅保障我国粮油安全，而且提升人民健康水平。此外，荒山、丘陵区种植油茶，不与粮棉争地，能够改善生态环境，具有重要生态价值。在我国各产区油茶炭疽病普遍发生，引起落果、落蕾、枝梢枯死等，甚至整株衰亡，造成重大经济损失，可减产10%～30%，重病区40%～50%。近年来，随着油茶种植面积不断扩大，炭疽病危害程度越来越严重，已限制我国油茶产业健康发展。

该病的病原菌为胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides，但是胶孢炭疽菌分布广泛，寄主泛多，存在种问遗传多样性。杜宜新等研究发现，番木瓜炭疽病菌菌丝生长最适温度为25～28℃，分生孢子萌发的最适温度为28～30℃；最适pH为6，分生孢子萌发的最适pH为5；黑暗条件下生长速度最快；葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉能促进分生孢子的萌发和形成；该菌的致死温度为55℃，10min.高洋等对墨兰炭疽病菌生物学特性进行研究，结果表明菌丝生长和孢子萌发最适温度为26℃，产生孢子最适温度为30℃；菌丝生长最适pH为7～8，产生孢子最适pH为7～9，孢子萌发最适pH为7；26℃下连续光照产孢量最多。目前，关于油茶炭疽病菌的生物学特性未见详细报道，需要深入了解病原菌特性，才能掌握该病害发病规律且制定科学防治技术措施。因此，本文对油茶炭疽病菌的生物学特性进行研究，以期为病害的科学防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

按照常规组织分离方法，供试菌株YX-1、MC-8和HA-7分离于采自阳新、麻城和红安的油茶发病叶片，经单孢纯化后保存在PDA斜面上，于4℃冰箱中保存备用。

1.2 温度对病原菌菌丝生长及分生孢子萌发的影响

从活化菌株YX-1、MC-8和HA-7菌落边缘打取直径6mm的菌丝块，将菌丝块接种于PDA平板中央，每皿接种1个菌丝块，然后分别置于5℃，10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃等不同温度进行菌丝生长培养。5d后用十字交叉法测量菌落直径。每个处理设置5个重复。

从供试菌株YX-1、MC-8和HA-7菌落挑取分生孢子团，用无菌水稀释成浓度为1×106个/mL的孢子悬浮液。将200μL分生孢子液置于凹槽玻片，分别于5℃，10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃等不同温度进行孢子萌发试验。每个处理设置5个重复。培养12h后统计孢子萌发数，计算孢子萌发率（%）。

1.3 pH值对病原菌菌丝生长及分生孢子萌发的影响

用HCl和NaOH调节液体培养基的pH值。设置3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0、10.0，11.0等9个不同pH处理。打取直径为6mm菌丝块接种在不同pH值的PDB培养液中，置于25℃恒温摇床（120rpm）条件下培养。每处理重复5次。培养5d后，收集菌丝、烘干并称重。

设置3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0、10.0，11.0共9个梯度pH缓冲液。取200μL浓度为1×10⁶个/mL分生孢子液分别与5mL不同pH缓冲液充分混合，然后取200μL混合液放入凹槽玻片，置于25℃恒温条件下培养。每个处理设置5个重复。培养12h后统计孢子萌发数，计算孢子萌发率（%）。

1.4 光照对病原菌菌丝生长及分生孢子萌发的影响

用直径6mm的打孔器在活化菌株YX-1、MC-8和HA-7菌落边缘打取菌丝块，将菌丝块接种于PDA平板中央，每皿接种1个菌丝块。将培养皿置于25℃人工气候培养箱。设置连续黑暗、12h光暗交替、连续光照3个处理（光源为普通日光灯18w，22cm），每个处理设置5个重复。5d后用十字交叉法测量菌落直径。

将200μL浓度为1×10⁶个/mL分生孢子液于凹槽玻片，设置连续黑暗、1h光暗交替、连续光照3个处理（光源为普通日光灯18W，22cm）。每个处理设置5个重复，25℃恒温培养6h后统计孢子萌发数，计算孢子萌发率（%）。

1.5 碳源对病原菌菌丝生长及产孢量的影响

以Czapek培养基为基础，分别以相同碳含量的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、甘露醇、可溶性淀粉代替蔗糖而配成含不同碳源的培养液。从预先活化菌落边缘挑取直径为6mm的菌丝块接种到不同碳源的100mL培养液中，于25℃、120rpm震荡培养。5d后，收集菌丝、烘干并称重。用血球计数板测量孢子浓度。以不加任何碳源为对照，每处理5个重复。

1.6 氮源对病原菌菌丝生长及产孢量的影响

以Czapek培养基为基础，分别以相同氮元素含量的氯化铵、尿素、蛋白胨、氯化铵、谷氨酸、硝酸钾、硝酸钠、酵母膏代替硝酸钾而配成含不同氮源的培养液。从预先活化菌落边缘挑取直径为6mm的菌丝块接种到含不同氮源的100mL培养液中，于25℃、120rpm震荡培养。5d后，收集菌丝、烘干并称重。用血球计数板测量孢子浓度。以不加任何氮源为对照，每处理5个重复，

1.7 菌丝与孢子的致死温度测定

将直径6mm菌丝块置于无菌离心管中，加入2mL无菌水，然后分别在40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃水浴处理10min，冷却后将菌丝块置于PDA平板中央，25℃恒温光照培养。5d后观察其生长情况。每处理重复5次，

分生孢子悬浮液的制备方法同上。取1mL孢子悬浮液于1.5mL离心管中，分别置于40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃水浴处理10min，冷却，25℃恒温光照培养12h后统计孢子萌发数。每个处理5次重复。

1.8 数据统计与分析

采用EXCEL进行作图。采用DPS软件（V3.01）进行数据统计分析，并用最小显著差数法（LSD）比较各处理之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 温度对病原菌菌丝生长及分生孢子萌发的影响

不同温度对菌株YX-1、MC-8和HA-7菌丝生长具有显著影响（图1）。试验结果表明，3个菌株在10～35℃的范围内均能生长，其中25～30℃的温度范围生长较好；菌丝生长最适温度为30℃。3个菌株在5℃和40℃时，菌丝均不生长。

不同温度对菌株YX-1、MC-8和HA-7的孢子萌发率有明显差异（图2）。实验结果表明，3个菌株的孢子萌发温度范围为10～35℃。在10～30℃范围内，分生孢子随着温度的升高，萌发率逐渐增加，在30℃萌发率达到最高。在5℃和40℃条件下供试菌株的分生孢子均不萌发。

2.2 pH值对病原菌菌丝生长及分生孢子萌发的影响

不同pH对菌株YX-1、MC-8和HA-7菌丝生长的影响存在显著差异（图3）。试验结果表明，菌株YX-1、MC-8和HA-7菌丝在pH为5.0～7.0范围的范围生长较好，其中pH6.0最为适宜。在pH为3.0～6.0范围内，菌株YX-1、MC-8和HA-7的菌丝干重随pH的升高而逐渐增加，在pH6.0时菌丝干重达到最高；在pH在6.0～11.0范围内，菌丝干重随着pH的升高而逐渐减少。

在不同pH条件下，菌株YX-1、MC-8和HA-7的孢子萌发率有显著变化（图4）。结果表明，在pH3.0～11.0范围内孢子均可萌发，在pH为5.0～7.0范围的范围孢子均萌发率较高，其中pH6.0时孢子均萌发率最高，YX-1孢子萌发率为95.6%，MA-8孢子萌发率为94%，HA-7孢子萌发率为92%。

2.3 光照对病原菌菌丝生长及分生孢子萌发的影响

供试菌株YX-1、MC-8和HA-7在连续光照、12h光暗交替、连续黑暗三种条件下培养5d后的菌落直径（图5），三种不同的光照处理之间存在一定差异性。结果表明，连续光照条件有利于菌丝生长；而连续黑暗培养条件不利于菌丝生长。

供试菌株YX-1、MC-8和HA-7的分生孢子在连续黑暗、光暗交替和连续光照三个条件下，30℃恒温培养6h后均能萌发，但是萌发率却存在显著差异（图6）。结果表明：光暗交替条件下3个菌株的分生孢子的萌发率最高，利于分生孢子萌发；连续黑暗条件下的分生孢子萌发率最低，不利于分生孢子。

2.4 碳源对病原菌菌丝生长及产孢量的影响

供试菌株YX-1、MC-8和HA-7在7种不同碳源的培养液中均能生长，但是菌丝干重却存显著差异（图7）。结果表明：供试菌株对可溶性淀粉的利用效果最好；其次，依次为蔗糖、葡萄糖、甘露醇、半乳糖；而对麦芽糖和乳糖的利用效果较差。

供试菌株YX-1、MC-8和HA-7在7种不同碳源的培养液中均能产孢，但产孢量存在显著差异（图8）。结果表明，供试菌株在7种含有不同碳源的培养液中，甘露醇有利于病原菌产孢；而半乳糖不利于病原菌产孢。

2.5 氮源对病原菌菌丝生长及产孢量的影响

供试菌株YX-1、MC-8和HA-7在8种不同氮源的培养液中均能生长，但菌丝干重存在显著差异（图9）。结果表明，供试菌株在8种含有不同氮源的培养液中，且对尿素的利用效果最好；而对谷氨酸的利用效果最差。

供试菌株YX-1、MC-8和HA-7在8种不同氮源的培养液中均能产孢，但产孢量存在显著差异（图10）。结果表明，供试菌株在8种含有不同氮源的培养液中，甘氨酸有利于病原菌产孢；而硝酸钾不利于病原菌产孢。

2.6 菌丝与孢子的致死温度测定

结果表明，菌株YX-1、MC-8和HA-7的菌丝块在40～50℃水浴处理10min在PDA平板培养基上仍可继续生长，在55℃水浴处理10min后不能继续生长，说明菌丝的致死温度为55℃，10min。孢子在40～50℃水浴处理10min后分生孢子仍能萌发；在55℃水浴处理10min后分生孢子不能萌发，说明孢子的致死温度为55℃，10min。

3 讨论

在10～35℃的温度范围内，油茶炭疽病菌菌丝能够生长以及分生孢子能够萌发，其中30℃最适宜菌丝生长和分生孢子萌发，而在5℃以下及40℃以上菌丝不能生长、分生孢子不能萌发。油茶炭疽病菌的温度特性可能与病害流行（发病高峰期7～9月）密切相关。该菌对pH值要求不严格，在pH3.0～11.0范围内菌丝能够生长和分生孢子可萌发，pH6.0最利于菌丝生长，pH5.0～7.0最适宜分生孢子萌发。这说明偏酸性环境有利于菌丝生长和分生孢子萌发。连续光照有利于菌丝的生长，光暗交替有利于分生孢子的萌发。该病原菌菌丝和分生孢子的最低致死温度均为55℃，10min。可溶性淀粉和尿素利于菌丝生长；乳糖和麦芽糖与谷氨酸的不利于菌丝生长。甘露醇有利于病原菌分生孢子的产生，半乳糖不利于病原菌产孢；甘氨酸利于病原菌产孢，硝酸钾不利于病原菌产孢。因此，合理施肥，尤其是尿素的合理使用，可以控制该病害发生。

（责任编辑：郑京津）