番茄红素在大鼠肝脏中的几何异构体组成

惠伯棣，冯润月，宫 平（北京联合大学应用文理学院食品科学系，北京 100191）



番茄红素在大鼠肝脏中的几何异构体组成

惠伯棣，冯润月，宫 平
（北京联合大学应用文理学院食品科学系，北京 100191）

摘 要：目的：测定大鼠肝脏组织中番茄红素的含量及番茄红素几何异构体（顺/反异构体）的组成，为番茄红素在体内的代谢及生物学功能研究提供参考。方法：选用大鼠为动物模型，用番茄提取物配制灌胃液。一次灌胃8 h后取大鼠肝脏组织，提取其中的番茄红素。应用C30-高效液相色谱-光电二极管阵列（C30-high performance liquid chromatography-photodiode array detection，C30-HPLC-PDA）法测定提取物中番茄红素的总量和几何异构体组成。结果：大鼠肝脏中总番茄红素含量为92.95 μg/g（以鲜质量计）。与灌胃液中的番茄红素几何异构体组成比较，大鼠肝脏组织中存在更多数量和种类的顺式异构体，包括13Z-番茄红素、11Z-番茄红素、9Z-番茄红素和5Z-番茄红素异构体。结论：这一现象对研究番茄红素在肝脏内的贮存、靶向调动和生物学功能具有重要意义。

关键词：番茄红素；几何异构体；肝脏；代谢

引文格式：

惠伯棣， 冯润月， 宫平.番茄红素在大鼠肝脏中的几何异构体组成［J］.食品科学， 2016， 37（13）: 189-193.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201613034. http://www.spkx.net.cn

HUI Bodi， FENG Runyue， GONG Ping.Geometric isomer composition of lycopene from rat liver［J］.Food Science， 2016，37（13）: 189-193.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613034. http://www.spkx.net.cn

番茄红素（l y c o p e n e）是一种类胡萝卜素（carotenoid），由碳氢元素组成。其半系统命名为ψ-胡萝卜素，分子式为C40H56。番茄红素分子由中央多聚烯链和开环末端基团构成。由于其具有高度不饱和性，番茄红素在理论上可形成多种几何异构体。在自然界中番茄红素通常以全反式异构体（all E-isomer）的形式存在。其分子结构见图1。

在自然界中，番茄红素同时还存在着少量顺式异构体（Z-isomer）。最常见的有13Z-番茄红素、9Z-番茄红素和5Z-番茄红素这3 种单顺式异构体［1］。由于其分子空间结构不同，番茄红素各异构体的生物学功能也有所不同。根据文献报道，在体外抗氧化实验中，全反式异构体的抗氧化性明显优于顺式异构体。但由于顺式异构体在体内溶解性好，生物利用度高，故其在体内的抗氧化性反而高于全反式异构体［2］。

番茄红素具有预防与治疗多种疾病的功能。这方面的研究成果及报道在近年来迅速增多，如防治前列腺增生及癌症［3］、体内抗氧化［4］、抗消化道癌变［5］、降低肺癌风险［6］、抗糖尿病［7］、控制体质量［8］等。因此番茄红素也被越来越多地考虑应用在功能性食品中［9］，从而进一步推动了对番茄红素在体内吸收、转运和代谢的研究，但目前其相关报道十分有限。已有的研究报道结果可概括为：被人体摄入的番茄红素经小肠吸收进入血清，然后被转运到靶器官。其中一部分转运到肝脏中贮存。当靶器官需要时，再从肝脏调出，再经血清转运至靶器官参与代谢反应［10］（图2）。肝脏在这一过程中被认为执行了“库”的功能。因此，研究肝脏中番茄红素的存在形式对探讨其在体内的转运和在靶器官中发生代谢反应的机制具有重要意义。

本课题组已经报道了一次口服番茄红素后雄性大鼠肝脏中番茄红素的积累情况［11］和应用C30-高效液相色谱-光电二极管阵列（C30-high performance liquid chromatographyphoto-diode array detection，C30-HPLC-PDA）分离和检测番茄红素几何异构体的方法［12-15］。本研究拟继续采用这一方法对大鼠肝脏中的番茄红素几何异构体组成进行检测，希望研究结果对揭示番茄红素在体内的转运和代谢机理有一定帮助。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与动物

番茄萃取物由新疆红帆生物科技有限公司提供，该产品为番茄果皮的超临界CO2流体萃取物。其总类胡萝卜素含量为6%，其中番茄红素占94.74%，β-胡萝卜素占5.26%（以上均为质量分数）。

番茄红素参比样品（商品号：L9879）购自美国Sigma公司，番茄红素含量为90%～95%。先用本研究所采用的色谱条件检测了其番茄红素几何异构体组成。其全反式异构体的比例大于99%。故使用前未经进一步纯化。

萃取用正己烷、甲醇、石油醚（沸点：60～90 ℃）为分析纯 北京化工厂；色谱用流动相乙腈、甲醇和甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE）为色谱纯美国迪马公司。

Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，体质量（350±5） g，购自北京大学医学部实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK（京）2006-0008。

1.2 仪器与设备

Multispec-1501型紫外-可见光分光光度计 日本岛津公司；Waters 1525 HPLC系统（配有PDA-2996检测器） 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 灌胃剂量的选择

大鼠的番茄红素灌胃剂量参照惠伯棣等［16］在番茄红素血清动力学研究中的剂量，为每次5.25 mg/只，折合标准体质量（50 kg）人体摄入量为每次150 mg/人。

1.3.2 灌胃液的配制

称取一定量的番茄萃取物完全溶于正己烷中，再混溶于100 mL豆油中。45 ℃、－0.06 MPa、避光条件下在旋转蒸发仪上将正己烷完全蒸出。用石油醚定量稀释油溶液。采用紫外-可见光分光光度计在475 nm波长处比色测定吸光度，根据下式计算油溶液中番茄红素的质量，使配制成的番茄红素油溶液终质量浓度为5.25 mg/mL，室温避光保存。

式中：m为样品中番茄红素的质量/g；V为样品溶液的体积/mL；A475 nm为样品的吸光度；ε为吸光系数，定义为在1 cm光程长的比色杯中1 g/100 mL溶质的理论吸收值，在此ε=3 450［17-18］。

操作注意事项：在蒸发正己烷期间应注意严格避光，以避免在加热的状态下油溶液中大量全反式番茄红素发生几何异构化；灌胃液的配制应遵循随用随配的原则，不建议将其放在冰箱中贮存，原因是在4 ℃条件下番茄红素在油溶液中已形成颗粒结晶，导致灌胃液不均匀和生物利用度下降。

1.3.3 实验动物灌胃与肝脏收集

雄性SD大鼠在动物房中用标准饲料饲养3 d后随机分为两组：第1组6 只，第2组3 只。第1组每只大鼠灌胃1 mL灌胃液，第2组每只大鼠灌胃1 mL豆油。根据惠伯棣等［16］的报道：摄入番茄红素12 h后，大鼠血清中番茄红素水平下降到最低检测限。又根据惠伯棣等［11］的报道，摄入番茄红素8 h后，雄性大鼠肝脏中番茄红素积累水平达到最高值。因此，在本实验中，灌胃8 h后采用股动脉放血法处死大鼠，取肝脏。第1组大鼠的平均肝质量为（11.72±0.74）g，第2组大鼠的平均肝质量为（11.81±0.24）g。

1.3.4 番茄红素的萃取与浓缩

大鼠肝脏中总类胡萝卜素萃取方法参照Khachik等［19］的方法并作适当优化以使番茄红素的萃取率提高，降解率降低：将大鼠肝脏用组织匀浆器进行破碎后，取4 g肝脏匀浆液加入2 mL甲醇（－20 ℃），振荡30 s，沉淀蛋白。向带有蛋白沉淀的悬浊液中加入3 mL正己烷，振荡10 min。4 600 r/min离心10 min，取上清液2.6 mL，用N2吹干至1 mL。全程避光，并于冰浴中操作。按上述方法萃取每只大鼠肝脏中的类胡萝卜素，10 000 r/min离心3 min。取上清液进样用于HPLC分析。

1.3.5 大鼠肝脏萃取物的C30-HPLC-PDA分析

用于本研究的C30-HPLC-PDA设备具有良好的稳定性和重现性（相对标准偏差＜7%）。HPLC条件已由丁靖等［20］报道，并优化如下：色谱柱：YMC Carotenoid S-5 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A：乙腈-甲醇（3∶1，V/V）；流动相B：MTBE；流动相A与B中分别加入体积分数为0.05%的三乙胺；线性梯度洗脱：B液在8 min内由体积分数0%增加至55%；8～40 min内B液维持在55%；流速：1.0 mL/min；检测波长：475 nm；PDA光谱收集范围：260～600 nm；进样量：20 μL。对各组分积分得峰面积。

1.3.6 灌胃液的C30-HPLC-PDA分析

取0.5 mL灌胃液，用正己烷定容至50 mL。取1 mL定容液，10 000 r/min离心3 min，取上清液进样。色谱条件同1.3.5节。

1.3.7 标准曲线的绘制

称取番茄红素参比样品1 mg（精确至0.000 1 g），加入1 mL二氯甲烷使其完全溶解，转移至25 mL棕色容量瓶中，用石油醚定容至25 mL，配制成40 μg/mL的储备液，保存于－20 ℃冰箱中。使用前用石油醚稀释为6 个不同质量浓度的工作液。取工作液分别进样，以C30-HPLC测定全反式番茄红素组分含量与其色谱峰面积的关系，得到质量浓度（x，μg/mL）-峰面积（y，μV·s）线性回归方程：y=296x（R2=0.996 0）。

1.3.8 各番茄红素几何异构体组分的定性与定量分析

根据组分的色谱行为和光谱特征对番茄红素几何异构体进行鉴定。根据各组分在HPLC图上的峰面积以及标准曲线回归方程计算各组分的质量浓度。

根据李京等［21］的报道，虽然番茄红素顺式异构体的吸光系数与全反式异构体不同，但这一结果尚未经其他研究团队证实。因此，在本研究中依旧根据番茄红素全反式异构体的吸光系数计算顺式异构体的含量。

2 结果与分析

2.1 灌胃液中类胡萝卜素组分的分离结果

本实验所用番茄红素萃取物为番茄果皮的超临界CO2萃取物，该萃取物中所含主要类胡萝卜素为番茄红素，此外，还含有少量的β-胡萝卜素。其中除全反式番茄红素外，还含有少量的顺式番茄红素。图3为番茄红素萃取物的C30-HPLC-PDA图。组分Ⅰ的保留时间与番茄红素全反式异构体参比样品的保留时间一致。

2.2 大鼠肝脏萃取物中类胡萝卜素组分的分离结果

图4为灌胃8 h后大鼠肝脏萃取物的C30-HPLC-PDA图。组分Ⅰ的保留时间与番茄红素全反式异构体参比样品的保留时间一致。

2.3 各组分电子吸收光谱特征比较

使用HPLC系统上配备的PDA检测器，可在线采集各组分的电子吸收光谱。图5为组分Ⅰ～Ⅴ的电子吸收光谱，各组分电子吸收光谱特征分析结果见表1。5 个组分的主吸收带最大吸收波长发生了7 nm的变化，而顺式峰最大吸收波长（362 nm）未见明显变化。

注：顺式峰相对强度=顺式峰强度/主峰强度；—.Ⅵ无顺式峰。

2.4 灌胃液与大鼠肝脏提取物中番茄红素几何异构体的定性分析

根据各组分的色谱行为和光谱特征对各组分定性，认为组分Ⅰ～Ⅵ分别为全反式-番茄红素、5Z-番茄红素、9Z-番茄红素、11Z-番茄红素、13Z-番茄红素和β-胡萝卜素，其中除了组分Ⅳ未得到质谱数据支持，其他均可由文献［13］支持。图6为4 种番茄红素顺式异构体的分子结构。

2.5 灌胃液与大鼠肝脏提取物中番茄红素几何异构体的定量分析

注：组分相对含量/%=（组分峰面积/总峰面积）×100。

由表2可知，在灌胃液中番茄红素的主要存在形式为全反式异构体，此外还含有少量的11Z-番茄红素异构体，其他种类异构体比例极低。与灌胃液相比，大鼠肝脏中含有大量的番茄红素顺式异构体，包括13Z-番茄红素、11Z-番茄红素、9Z-番茄红素、5Z-番茄红素异构体。换言之，从大鼠肝脏中检测出的番茄红素组分中，顺式异构体比例明显上升，总顺式异构体比例超过60%，同时全反式番茄红素比例下降。

3 讨 论

本研究发现，全反式番茄红素在大鼠肝脏中以大量顺式异构体形态存在，这一现象在国内外文献中尚未见报道。这一现象的发现可能对番茄红素生物学功能和其在体内的代谢研究产生重要影响。根据惠伯棣等［16］的报道，番茄红素在血液中的存在形式就包括大量顺式异构体。因此，来自消化道的全反式异构体发生顺式异构化应该不是发生在肝脏中。

此外，由于不同异构体在体内的溶解性和抗氧化能力均有所不同［22］，可以设想在肝脏内中存在的顺式异构体具有不同于全反式异构体的生物学功能。当体内靶器官需要调动贮存在肝脏内的番茄红素时，肝脏中的各种几何异构体以何种形态和数量再度进入血液是非常值得探讨的问题。本研究结果将有助于推动番茄红素在体内代谢和生物功能研究的进一步发展。

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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613034

中图分类号：TS201.2

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2016）13-0189-05

收稿日期：2015-07-24

基金项目：北京市教委科技发展计划重点项目（KZ20051147020）

作者简介：惠伯棣（1959—），男，教授，博士，研究方向为类胡萝卜素化学及生物化学。E-mail：bodi_hui@buu.edu.cn

Geometric Isomer Composition of Lycopene from Rat Liver

HUI Bodi， FENG Runyue， GONG Ping
（Department of Food Science， College of Applied Arts and Science， Beijing Union University， Beijing 100191， China）

Abstract:Total lycopene amount and lycopene geometric isomer composition of rat liver were determined in this study，aiming to lay a foundation for in vivo studies on lycopene metabolism and biological function.In the experiment， male rats were administrated with tomato extract at a single dose.After 8 h， liver tissues were collected for the extraction of lycopene.The total amount and geometric isomer composition of lycopene were determined by C30-high performance liquid chromatography with photodiode array detection （C30-HPLC-PDA）.Results indicated that total amount of lycopene from liver tissues was 92.95 μg/g fresh weight.In comparison with tomato extract， the composition and amount of lycopene Z-isomers （including 13Z-， 11Z-， 9Z- and 5Z-isomer） were increased in rat liver tissues.This phenomenon is important for investigating the storage， targeting transfer and biological function of lycopene in liver.

Key words:lycopene； geometric isomer； liver； metabolism