紫外诱变筛选柄篮状菌尿嘧啶缺陷型菌株

周志义，张佑红，耿安丽

(武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉 430073)



紫外诱变筛选柄篮状菌尿嘧啶缺陷型菌株

周志义，张佑红，耿安丽

(武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉 430073)

摘要：柄篮状菌EMM是一株从原始菌OPC4诱变获得的高产纤维素酶菌株。为了获得转化用的宿主菌，通过紫外诱变的方法，在1.5 g·mL-15-FOA的筛选压力下，从EMM诱变得到一株尿嘧啶营养缺陷型菌株EMU6。从原始菌OPC4的基因组里克隆出2 553 bp的pyrF基因，NCBI比对发现，pyrF为编码乳清酸磷酸核糖基转移酶的基因，影响尿嘧啶的合成。测序比对发现，尿嘧啶营养缺陷型菌株EMU6的pyrF基因在1 160 bp处有一个核苷酸缺失。柄篮状菌尿嘧啶营养缺陷型菌株的获得使基于pyrF基因转化体系的建立成为可能。

关键词：柄篮状菌；尿嘧啶营养缺陷型；PEG/CaCl2转化法；pyrF；紫外诱变

木质纤维素是世界上最丰富的生物能源材料，大量的糖类以纤维素和半纤维素的形式存在其中，因而成为生物乙醇生产最有潜力的来源[1-2]。相较于其它生物能源材料，木质纤维素生产生物乙醇的最大优势是不会消耗粮食[3]。木质纤维素生产生物乙醇的第一步是将其水解成单糖，常用的方法有2种：化学处理和酶处理。化学处理所用的试剂会污染环境且处理不充分，酶处理则不需使用其它化学试剂而且环保[4-5]。水解木质纤维素的酶主要有纤维素酶和半纤维素酶，这两种酶的高成本制约着酶处理在工业上的广泛应用[6]。

本课题组从自然界中分离出柄篮状菌OPC4，经多次诱变得到纤维素酶高产菌EMM，优化了其发酵条件。为进一步提高其产酶量，欲利用基因工程过量表达EMM纤维素酶和半纤维素酶。为了能将待表达的基因顺利导入EMM，首先要建立一个适合柄篮状菌的转化体系。真菌的转化方法一般有3种：PEG/CaCl2转化法、农杆菌转化法、电转化法[7]。由于农杆菌转化法过于复杂，电转化法条件不好摸索[8]，而从柄篮状菌菌丝制备原生质体[9]比较简单而且量大，故选择PEG/CaCl2转化法。标记基因主要有3类：药物抗性标记基因、营养缺陷型标记基因及功能标记基因[10-11]。由于要转化多个基因，需建立一个可以重复使用的标记基因，营养缺陷型标记基因pyrF可重复使用且操作方法简单成熟。pyrF为编码乳清酸磷酸核糖基转移酶的基因，影响尿嘧啶的合成，可用5-氟乳清酸(5-FOA)筛选[12]。

作者以紫外诱变筛选得到的一株尿嘧啶营养缺陷型菌株作为宿主菌，在克隆出柄篮状菌pyrF基因的基础上，建立了以pyrF为标记基因的转化体系，为后续外源基因的导入打下基础。

1实验

1.1材料

1.1.1质粒与菌种

用于转化的载体pGEF2自行构建，以pGEM-T为骨架，引入pyrF片段。大肠杆菌(E.coli)DH5α、原始菌柄篮状菌OPC4及其诱变菌株EMM，自行保存。

1.1.2酶与试剂

DNA聚合酶、T4连接酶、phusion高保真酶，Thermo Scientific公司；pGEM-Teasy Vector，Promega公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒，Omega Bio-Tek公司。

尿嘧啶核苷(Uracil)、氨苄青霉素(Amp)、5-氟乳清酸(5-FOA)、裂解酶，Sigma公司；引物由Sigma公司合成。

1.1.3培养基

采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)进行原始菌柄篮状菌菌丝的培养。基础培养基配方如下：NH4Cl 1.4 g·L-1，KCl 1.4 g·L-1，KH2PO42 g·L-1，MgSO40.3 g·L-1，葡萄糖15 g·L-1，微量元素1 mL·L-1，5-FOA 1.5 g·L-1，尿嘧啶2 g·L-1。

1.2方法

1.2.190%致死率紫外线照射时间的选择

从PDA平板取新鲜的EMM孢子，用10 g·L-1NaCl溶液将孢子浓度调至1×104个·mL-1，取5 mL置于无菌平皿内，平放在40 W紫外灯管下35 cm处，分别照射0 s、30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s后取200 μL涂布在基础培养基平板上，30 ℃培养3 d，统计平板上的菌落数，计算存活率，确定90%致死率的紫外线照射时间[13]。

1.2.25-FOA最小抑制浓度的选择

将新鲜培养的EMM孢子浓度调至1×104个·mL-1，取200 μL分别涂布在含有不同浓度5-FOA的基础培养基上，30 ℃培养3 d，观察各平板上EMM的生长情况，确定5-FOA对EMM的最小抑制浓度。

1.2.3尿嘧啶营养缺陷型菌株的筛选

将新鲜培养的EMM孢子浓度调至1×106个·mL-1，在紫外线照射90%致死率的时间后，取200 μL涂布在含有尿嘧啶和5-FOA的基础培养基平板上，30 ℃培养3 d。挑选单菌落分别接种到含与不含尿嘧啶的基础培养基平板上，对比生长状态，筛选出EMM尿嘧啶营养缺陷型菌株。

1.2.4原始菌OPC4 pyrF基因的克隆

采用玻璃珠振荡破壁法[14]从OPC4菌丝体中提取基因组DNA，并根据柄篮状菌基因组设计引物将pyrF克隆出来，pyrF上游引物pyrF1：5′-GGTCTAGAGGATCCTGTCACAGTGTCGGTACTG-3′，下游引物pyrF2：5′-GGGAATTCCATGCATGTTGAT-AGGTCGGTCAAT-3′。获得长度为2.6 kb的DNA片段，目的条带胶回收后加A连接到pGEM-Teasy Vector上，大肠杆菌转化后获得阳性克隆，摇菌过夜，提取质粒pGEF2后送Sigma公司测序。

1.2.5pyrF基因突变株的筛选

用phusion高保真酶以pyrF上下游引物pyrF1和pyrF2扩增出尿嘧啶营养缺陷型菌株的pyrF基因，将其送Sigma公司测序，用DNASTAR软件进行比对，确定突变位点。

2结果与讨论

2.190%致死率紫外线照射时间的确定

为了确定最适紫外诱变时间，对EMM紫外线照射不同时间，得到的存活率曲线见图1。

图1　EMM的存活率曲线Fig.1　Survival curve of strain EMM

由图1 可知，90 s为EMM的90%致死率紫外线照射时间。

2.25-FOA 最小抑制浓度的确定

观察EMM在不同浓度5-FOA平板上的生长情况，结果见表1。

表15-FOA对EMM的抑制作用

Tab.1　Inhibition effect of 5-FOA on strain EMM

注：“++”表示生长正常，“+”表示生长微弱，“-”表示不能生长。

由表1可知，随着5-FOA浓度的增大，菌株EMM的生长减慢，当5-FOA浓度为1.5 g·L-1时，EMM已不能生长。故确定1.5 g·L-1为5-FOA对EMM的最小抑制浓度。

2.3尿嘧啶营养缺陷型菌株的筛选

EMM可以在不含尿嘧啶的平板上生长，但不能在含5-FOA的平板上生长；尿嘧啶营养缺陷型菌株不能在不含尿嘧啶的平板上生长，但可以在含5-FOA与尿嘧啶的平板上生长，这可以作为筛选尿嘧啶营养缺陷型菌株的依据。经紫外诱变后得到6株能在含5-FOA与尿嘧啶平板上生长的菌株，分别命名为EMU1～EMU6，然后将它们分别涂布在含尿嘧啶和不含尿嘧啶的平板上。结果发现，EMU1～EMU6均能在含尿嘧啶的平板上生长，但只有EMU6不能在不含尿嘧啶的平板上生长(图2)。由此可以基本证明EMU6为尿嘧啶营养缺陷型菌株。

图2　尿嘧啶营养缺陷型菌株的筛选Fig.2　Isolation of uracil auxotrophic strain

2.4原始菌基因组 DNA 的提取

利用pyrF引物从OPC4基因组中克隆出一条2.6 kb的片段，测序结果的BLAST比对显示，该片断与Talaromycescellulolyticus(Y-94)编码乳清酸磷酸核糖基转移酶的pyrF基因(AB668056.1)同源性高达97%。将这2个基因分别翻译成氨基酸序列后进行比对，发现有6个氨基酸存在差异(图3)。

图3　EMM与Y-94乳清酸磷酸核糖基转移酶推导氨基酸序列的比对结果Fig.3　Comparison of the deduced amino acid sequence of the OPRTase from EMM and Y-94

2.5pyrF基因突变株的筛选

EMM和尿嘧啶营养缺陷型菌株EMU6的pyrF基因测序结果见图4。

由图4可知，与原始菌OPC4的pyrF基因比对发现，EMU6的pyrF基因在1 160 bp处发生了核苷酸缺失，造成乳清酸磷酸核糖基转移酶的失活。pyrF基因在1 160 bp处发生核苷酸缺失导致EMU6不能产生乳清酸磷酸核糖基转移酶。乳清酸磷酸核糖基转移酶是尿嘧啶合成中的关键酶，它的缺失使EMU6不能在没有尿嘧啶的培养基上生长。

图4EMU6与EMMpyrF基因的部分序列比对结果

Fig.4Partial sequence comparison ofpyrFgene from EMU6 and EMM

3结论

通过紫外诱变的方法从柄篮状菌EMM诱变得到了一株尿嘧啶营养缺陷型菌株EMU6，对EMU6的pyrF基因测序，测序结果与原始菌OPC4的pyrF基因比对发现，EMU6的pyrF基因在1 160 bp处发生了核苷酸缺失，造成乳清酸磷酸核糖基转移酶的失活。

柄篮状菌尿嘧啶缺陷型菌株的成功获得，使得后续在分子上的基因表达调控和蛋白分泌研究成为可能。pyrF作为一种营养缺陷型标记基因，可以将其构建成可循环使用的标记基因表达盒，这将为后续多基因的表达和调控提供便利，对真菌的研究具有重要价值。

参考文献：

[1]LEVIN D B,PITT L,LOVE M.Biohydrogen production,prospects and limitations to practical application[J].International Jounral of Hydrogen Energy,2004,29(2):173-185.

[2]LEVIN D B,SPARLING R,ISLAM R,et al.Hydrogen production byClostridiumthermocellum27405 from cellulosic biomass substrates[J].International Journal of Hydrogen Energy,2006,31(11):1496-1503.

[3]LYND L R.Overview and evaluation of fuel ethanol from lignocellulosic biomass:technology,economics,the environment,and policy[J].Annu Rev Energy Environ,1996,21:403-465.

[4]HIDENO A,INOUE H,TSUKAHARA K,et al.Wet disk milling pretreatment without sulfuric acid for enzymatic hydrolysis of rice straw[J].Bioresour Technol,2009,100:2706-2711.

[5]ENOCH Y P,KAZUYA N,TATSUYA K.Improvement of cellulase production in cultures ofAcremoniumcellulolyticususing pretreated waste milk pack with cellulase targeting for biorefinery[J].Bioresource Technology,2011,102:6120-6127.

[6]CARERE C R,SPARLING R,CICEK N,et al.Third generation biofuelsviadirect cellulose fermentation[J].International Journal of Molecular Sciences,2008,9(7):1342-1360.

[7]OLMEDO-MONFIL V,CORTES-PENAGOS C,HERRERAE-STRELLA A.Three decades of fungal transformation key concepts and applications[J].Methods Mol Biol,2004,267:297-313.

[9]FU G，XU Y，LI Y，et al.Construction of a replacement vector to disruptpksCTgene for the mycotoxin citrinin biosynthesis inMonascusaurantiacusand maintain food red pigment production[J].Asia Pac J Clin Nutr,2007,16:137-142．

[10]RUIZ-DIEZ B.Strategies for the transformation of filamentous fungi[J].J Appl Microbiol,2002,92:189-195.

[11]CAMPOY S,PREZ F,MARTIN J F,et al.Stable transformation of the azaphilone pigment-producingMonascuspurpureusobtained by protoplast transformation and Agrobacterium-mediated DNA transfer[J].Curr Genet,2003,43:447-452.

[12]FUJII T,IWATA K,MURAKAMI K,et al.Isolation of uracil auxotrophs of the fungusAcremoniumcellulolyticusand the development of a transformation system with thepyrFgene [J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,2012,43:245-249.

[13]MATTERN I E,van NOORT J M,van den BERG P,et al.Isolation and characterization of mutants ofAspergillusnigerdeficient in extracellular proteases[J].Molecular and General Genetics,1992,234(2):332-336.

[14]YU J H,HAMARI Z,HAN K H,et al.Double-joint PCR:a PCR-based molecular tool for gene manipulations in filamentous fungi[J].Fungal Genetics and Biology,2004,41:973-981.

[15]HASHIMOTO S,OGURA M,ARITOMI K,et al.Isolation of auxotrophic mutants of diploid industrial yeast strains after UV mutagenesis[J].Appl Environ Microbiol,2005,71:312-319.

基金项目：新加坡国立研究基金会项目(NRF20100TH-TRD001-003)

收稿日期：2016-03-25

作者简介：周志义(1992-)，男，湖北武汉人，硕士研究生，研究方向：制药工程，E-mail：zhouzhiyi1992@gmail.com；通讯作者：张佑红，教授，E-mail：youhong@aliyun.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.07.011

中图分类号：TQ 351.011

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)07-0048-04

Isolation ofTalaromycesstipitatusUracil Auxotrophic Strain by UV Mutagenesis

ZHOU Zhi-yi，ZHANG You-hong，GENG An-li

(SchoolofChemicalEngineeringandPharmacy,WuhanInstituteofTechnology,Wuhan430073,China)

Abstract：Talaromyces stipitatus EMM is a high cellulase-producing strain that mutated from Talaromyces stipitatus OPC4.In order to prepare host strains for the transformation,a uracil auxotrophic strain EMU6 was isolated by resistance to 5-FOA after UV mutagenesis from EMM.pyrF Gene with 2 553 bp was cloned from strain OPC4 gene.NCBI Result showed that pyrF was an encoding orotate phosphoribosyl transferase gene which affected uracil synthesis.Sequence analysis indicated that,the mutated pyrF gene of EMU6 had one nucleotide deletion at 1 160 bp.The isolation of Talaromyces stipitatus uracil auxotrophic strain makes it possible for construction of the transformation system with pyrF gene.

Keywords：Talaromyces stipitatus;uracil auxotroph;PEG/CaCl2 transformation method;pyrF;UV mutagenesis

周志义，张佑红，耿安丽.紫外诱变筛选柄篮状菌尿嘧啶缺陷型菌株[J].化学与生物工程，2016，33(7)：48-51.