水溶性阳离子卟啉化合物i-TMPipEOPP的DNA光切割作用研究

杨　琳，石　珊，朱莉娜，张立娜，刘珂珂

(天津大学理学院，天津 300072)



水溶性阳离子卟啉化合物i-TMPipEOPP的DNA光切割作用研究

杨琳，石珊，朱莉娜，张立娜，刘珂珂

(天津大学理学院，天津 300072)

摘要：利用琼脂糖凝胶电泳法研究了水溶性阳离子卟啉化合物i-TMPipEOPP对超螺旋pBR322质粒DNA的光切割作用。结果表明：i-TMPipEOPP对DNA具有较好的光切割作用。在黑暗条件下，i-TMPipEOPP的存在不会对DNA造成损伤；但在光照条件下，较低浓度(0.6 μmol·L-1)i-TMPipEOPP表现出显著的光切割活性，将超螺旋pBR322 DNA(Form Ⅰ)完全转化为缺口型DNA(Form Ⅱ)，且反应符合伪一级动力学模型。机理研究表明，i-TMPipEOPP对DNA的光切割作用可能归因于在反应过程中生成的单线态氧和超氧阴离子。而i-TMPipEOPP在偏酸性条件下对DNA显示出更高的光切割活性，i-TMPipEOPP有望成为一种对肿瘤细胞具有更高选择性的潜在的光动力学治疗试剂。

关键词：阳离子卟啉；光切割；双链DNA；生物活性

图1　i-TMPipEOPP的化学结构1　Chemical structure of i-TMPipEOPP

1实验

1.1试剂

i-TMPipEOPP，本课题组合成[11]；超螺旋pBR322质粒DNA，TaKaRa公司；电泳级琼脂糖，上海生工生物工程技术服务有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)，北京鼎国生物技术有限公司；Tris、HCl、KCl、MgCl2、KI、DMSO、NaN3、Na2EDTA、C2H5OH，Sigma公司。所用试剂均为分析纯。

1.2DNA光切割实验

反应液总体积为25 μL，包括10 ng·μL-1pBR322 DNA、25 mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液(pH=5.0)、0.6 μmol·L-1i-TMPipEOPP。反应液在日光下保持25 ℃照射2 h，然后加入2 μL上样缓冲溶液(0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯腈、30%甘油)终止反应。取25 μL反应液加入到琼脂糖凝胶(质量浓度为1%，含有1 μg·mL-1的溴化乙锭)中，加入TBE缓冲溶液(90 mmol·L-1Tris-borate，pH=8.3，20 mmol·L-1Na2EDTA)，在80 V电压下电泳45 min。取出凝胶后置于紫外透射仪中观看并照相。用Gel-Pro Analyzer软件分析。由于结构的影响，溴化乙锭对超螺旋型质粒DNA染色能力较差，故将分析数值乘以1.3加以修正[12]。

2结果与讨论

2.1i-TMPipEOPP对DNA的光切割作用

分别做了光照和黑暗条件下i-TMPipEOPP存在与不存在时对双链DNA的切割实验，结果见图2。

1.黑暗条件下，DNA+i-TMPipEOPP　2.光照条件下，DNA+i- TMPipEOPP　3.黑暗条件下，DNA　4.光照2 h、pH=5.0条件下，DNA图2　i-TMPipEOPP对pBR322质粒DNA的光切割作用Fig.2　Photocleavage of pBR322 plasmid DNA by i-TMPipEOPP

由图2可以看出，无论光照还是黑暗条件下，没有i-TMPipEOPP存在时，DNA不发生切割反应；而当i-TMPipEOPP存在时，DNA仅在光照条件下发生切割反应，超螺旋型质粒DNA(Form Ⅰ)完全转化为缺口型质粒DNA(Form Ⅱ)。表明，当无光照时，i-TMPipEOPP对DNA是安全的；当有光照时，会发生光诱导的DNA切割作用，表现出明显的光动力学效应。该特性满足PDT光敏剂的初步要求，表明该卟啉化合物有望成为PDT光敏剂。

2.2i-TMPipEOPP浓度对DNA光切割作用的影响

在25 ℃、pH=5.0的条件下，考察i-TMPipEOPP浓度对pBR322质粒DNA光切割作用的影响，结果见图3。

pBR322 DNA浓度10 ng·μL-1；反应时间2 h；i-TMPipEOPP浓度(μmol·L-1)，1～8：0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7图3　i-TMPipEOPP浓度对pBR322质粒DNA光切割作用的影响Fig.3　Effect of i-TMPipEOPP concentration on photocleavage of pBR322 plasmid DNA

由图3可以看出，质粒DNA光切割反应活性与i-TMPipEOPP浓度有密切关系。随着i-TMPipEOPP浓度的增加，其对DNA切割能力显著增强，超螺旋型DNA(Form Ⅰ)含量逐渐减少，缺口型DNA(Form Ⅱ)含量逐渐增加。在i-TMPipEOPP浓度为0.6 μmol·L-1时，pBR322质粒DNA从超螺旋型DNA(Form Ⅰ)几乎完全转化为缺口型DNA(Form Ⅱ)。进一步表明，DNA光切割反应确实是由i-TMPipEOPP引起的。

2.3pH值对DNA光切割作用的影响(图4)

i-TMPipEOPP浓度0.6 μmol·L-1；反应时间2 h；pH值， 1～9：5.0、6.0、7.0、7.2、7.4、7.6、8.0、9.0、10.0图4　pH值对pBR322质粒DNA光切割作用的影响Fig.4　Effect of pH value on photocleavage of pBR322 plasmid DNA

由图4可知，在pH值为5.0～10.0范围内，随着pH值的降低，i-TMPipEOPP对DNA切割能力显著增强，超螺旋型DNA(Form Ⅰ)含量逐渐减少，缺口型DNA(Form Ⅱ)含量逐渐增加。在pH值为5.0和6.0时，pBR322质粒DNA被完全切割。当pH值低于7.2时，出现线型DNA(Form Ⅲ)，意味着缺口型DNA(Form Ⅱ)被进一步切割成线型。研究表明，生物体内肿瘤细胞的pH值范围较正常细胞偏低[13]。因此，i-TMPipEOPP在偏酸性条件下对双链DNA更强的光切割作用表明其对肿瘤细胞可能具有更高的选择性。

2.4i-TMPipEOPP对DNA光切割作用的动力学研究

研究了不同形式DNA含量随时间变化的规律，结果见图5。

由图5可以看出，随着反应时间的延长，超螺旋型DNA(Form Ⅰ)含量逐渐减少，缺口型DNA(Form Ⅱ)含量逐渐增加。当反应时间达到120 min时，pBR322 DNA从超螺旋型(Form Ⅰ)几乎完全转化为缺口型(Form Ⅱ)。将凝胶电泳实验数据用Gel-Pro Analyzer软件进行分析，得到不同形式DNA占总DNA含量的百分比，绘出拟合曲线(图5b)。由图5b可以看出，这是一个典型的伪一级反应，运用如下的伪一级反应的动力学方程对实验数据进行拟合：

pH=5.0；i-TMPipEOPP浓度0.6 μmol·L-1；反应时间(min)， 1～11：0、10、20、30、40、50、60、80、100、120、140图5　反应时间对pBR322质粒DNA光切割作用的影响(a)和不同形式DNA含量随反应时间的变化(b)Fig.5　Effect of reaction time on photocleavage of pBR322 plasmid DNA(a) and change of the content of different forms of DNA with reaction time(b)

2.5i-TMPipEOPP对DNA光切割作用机理的初步研究

为了研究i-TMPipEOPP对pBR322质粒DNA光切割作用的机理，在反应体系中分别加入几种常见的抑制剂，考察其对DNA光切割作用的影响，结果见图6。

i-TMPipEOPP浓度0.6 μmol·L-1　1.DNA　2.DNA+i-TMPipEOPP 3.DNA+i-TMPipEOPP+NaN3(60 mmol·L-1)　4.DNA+i- TMPipEOPP+SOD(500 U·mL-1)　5.DNA+i-TMPipEOPP+KI (0.12 mmol·L-1) 　6.DNA+i-TMPipEOPP+DMSO(1.706 mol·L-1) 7.DNA+i-TMPipEOPP+C2H5OH(1.715 mol·L-1)图6　抑制剂存在下i-TMPipEOPP对 pBR322质粒DNA光切割作用的影响Fig.6　i-TMPipEOPP-induced photocleavage of pBR322 plasmid DNA in the presence of different inhibitors

由图6可以看出，在体系中加入常见的羟基自由基清除剂如KI、DMSO、C2H5OH时，缺口型DNA(Form Ⅱ)含量并未发生明显的变化。但在体系中加入NaN3(单线态氧清除剂)或超氧化物歧化酶SOD(超氧阴离子清除剂)时，超螺旋型DNA(Form Ⅰ)含量显著增加，说明反应过程中生成了单线态氧和超氧阴离子，使得i-TMPipEOPP对pBR322质粒DNA的光切割反应明显受到了抑制。这与之前报道的卟啉是一种良好的单线态氧光敏剂相一致[14-15]。

3结论

研究了水溶性阳离子卟啉化合物i-TMPipEOPP对超螺旋pBR322质粒DNA的光切割活性。在黑暗条件下，i-TMPipEOPP并未对质粒DNA进行切割；而光照条件下，i-TMPipEOPP在较低浓度(0.6 μmol·L-1)时表现出显著的光切割活性。机理研究发现，在反应过程中生成了单线态氧和超氧阴离子，进而完成对DNA的光切割。i-TMPipEOPP对pH值有一定的选择性，偏酸性条件下对DNA光切割活性更高，这使得i-TMPipEOPP有望成为一种潜在的具有选择性的光动力抗癌药物。

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基金项目：国家自然科学基金资助项目(21371130)，天津市应用基础与前沿技术研究计划一般项目(15JCYBJC48300)

收稿日期：2016-03-08

作者简介：杨琳(1988-)，女，河南周口人，硕士研究生，研究方向：生物无机化学，E-mail：yl18222529535@163.com；通讯作者：朱莉娜，副教授，E-mail：linazhu@tju.edu.cn。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.07.005

中图分类号：O 643.36

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)07-0019-04

DNA Photocleavage by Water-soluble Cationic Porphyrini-TMPipEOPP

YANG Lin,SHI Shan,ZHU Li-na,ZHANG Li-na,LIU Ke-ke

(SchoolofScience,TianjinUniversity,Tianjin300072,China)

Abstract：An agarose gel electrophoresis method was used to study the photocleavage of pBR322 supercoiled DNA by a water-soluble cationic porphyrin i-TMPipEOPP.Results showed that i-TMPipEOPP exhibited good DNA photocleavage performance.i-TMPipEOPP had no DNA damage ability in dark,but was able to completely convert the pBR322 supercoiled DNA(Form Ⅰ) to nick DNA(Form Ⅱ) at a low concentration of 0.6 μmol·L-1under the light irradiation,and the reaction was in accordance with the pseudo-first reaction kinetic model.The reactive oxygen species1O2 and in the reaction process might play a major role in the photocleavage reaction.i-TMPipEOPP shows higher photocleavage activity under acidic conditions,which makes it a promising anti-tumor PDT agent.

Keywords：cationic porphyrin;photocleavage;double-stranded DNA;biological activity

杨琳，石珊，朱莉娜，等.水溶性阳离子卟啉化合物i-TMPipEOPP的DNA光切割作用研究[J].化学与生物工程，2016，33(7)：19-22.