融合短肽促进碱性果胶酶的高效表达

汪明星，刘　松，刘　龙*，堵国成，陈　坚

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122）

融合短肽促进碱性果胶酶的高效表达

汪明星1，2，刘松1，2，刘龙*1，2，堵国成1，2，陈坚1，2

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122）

碱性果胶酶（PGL）是一种重要的工业酶，广泛应用于食品、纺织和造纸等行业。作者将6种双亲短肽（SAP）融合至PGL N端，以期提高PGL在大肠杆菌中的分泌表达效率。得到一株高产菌株PGL-S1，胞外酶活由129.65 U/mL提高到535.47 U/mL，其他5种短肽则酶活降低。通过SDS-PAGE检测发现，PGL-S1的表达量并没有多大变化，推测可能是催化效率提高引起酶活提高。分析双亲短肽的疏水性指数发现，SAP1的疏水性不同于其他短肽，疏水性是蛋白质发生聚集的主要作用力，能够固定N、C末端，加强与底物的相互作用。推测PGL-S1融合蛋白的表面疏水性提高，促进了对底物的催化效率，具有巨大的工业应用潜力。

碱性果胶酶；双亲短肽；高效表达；疏水性指数；催化效率

果胶酶是能够分解果胶质的酶的总称，广泛存在于各种微生物中，细菌、真菌和放线菌都能产生相关酶类。根据不同底物，果胶酶可以分成以下几类：多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果胶酸裂解酶（PL）和果胶酯酶 （PE）［1］。碱性果胶酶 （E.C.4.2.2.2，简称PGL），全称聚半乳糖醛酸裂解酶，其可以在碱性条件下，将果胶质分解为不饱和的寡聚半乳糖醛酸。果胶酶在食品加工、饲料加工、纺织、造纸、环境保护等方面应用广泛［2-3］。尤其在纺织行业中，由于传统精炼工艺能耗大污染严重，碱性果胶酶作为一种生物制剂，顺应了绿色生产加工和可持续发展的要求，慢慢取代了传统工艺。随着碱性果胶酯裂解酶新用途的不断出现，对该酶的需求量越来越大，因此提高碱性果胶酶的产量受人关注。

促进酶的高效表达有很多方法，例如异源表达［4］、发酵优化［5］，诸葛斌等人成功地将来源于枯草芽孢杆菌 WSHB04-02的 PGL基因在 P.pastoris GS115中实现整合分泌表达，优化后现PGL胞外表达量已为全球领先［6-7］。然而，毕赤酵母表达体系存在很多难以克服的问题，比如发酵周期长、过程控制复杂和低温诱导能耗高等。解决这些问题的最有效方法是建立并深化原核表达体系，以实现发酵周期短、过程简便、低能耗的PGL高效表达。

据报道，双亲短肽 （SAPs）与蛋白末端融合，SAPs形成的水凝胶能够对酶分子进行固定化，提高酶的催化效率和稳定性，从而提高酶活。杨海泉等将双亲短肽与碱性淀粉酶N端融合，得到酶活提高3.2倍的重组碱性淀粉酶［8］。

作者对6种不同性质的SAPs分析，将其与PGL N端融合，发酵测PGL酶活。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株与质粒E.coli JM109，E.coli BL21 （DE3），Bacillus sp.WSHB04-02和pET-22b（+）：作者所在实验保存。

1.1.2双亲短肽SAPs清华大学林章凛教授的研究发现，融合强疏水性的双亲短肽会使重组酶以有活性的包涵体形式出现在胞内［8］。为避免融合蛋白形成包涵体，作者选择了亲水性较强双亲短肽作为研究对象。编码6个短肽的基因，以及在其N端的6×His-tag和 C端的 PT linker（PTPPTTPTPPTTPT PT）基因，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。随后与质粒pET-22b（+）连接，详细的SAPs信息见表1。

表1　　双亲短肽的氨基酸序列及结构特点Table 1　Sequence，character and scoure of SAPs

1.1.3培养基

1）LB培养基：酵母粉 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L；pH 7.0。

2）种子培养基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，葡萄糖20 g/L；pH 7.0。

3）发酵培养基（TB）：酵母粉24 g/L，胰蛋白胨12 g/L，甘油5 g/L，K2HPO472 mmol/L，KH2PO417 mmol/L。

1.2方法

1.2.1PGL基因扩增用表2中引物PCR扩增PGL基因片段，在上下游分别加上NcoI和XhoI两个酶切位点。

表2　　引物序列Table 2　Primer Sequence

1.2.2胶回收详见 TAKARA公司胶回收试剂盒的产品说明书。

1.2.3连接使用TAKARA公司连接试剂盒分别将双亲短肽，PGL基因依次与整合好的 pET-22b （+）连接。

1.2.4转化将连接好的pET-22b（+）/pgl-S转进JM109，测序正确后转进E.coli BL21（DE3）。

1.2.5培养方法

1）种子培养：从甘油管中将重组菌E.coli BL21 （DE3）（pET-22b（+）/pgl-S）接种于含有100滋g/mL氨苄青霉素和 2 g/dL葡萄糖的LB培养基中，装液量为20 mL/250 mL。培养温度 37℃，200 r/min摇床上振荡培养10 h。

2）摇瓶发酵：将培养10 h的种子液以3%的接种体积分数接入含有 100滋g/mL氨苄青霉素的发酵培养基TB中，装液量为20 mL/250 mL，于37℃、200 r/min培养。菌体生长到一定阶段（OD600=0.6），加入终浓度0.04 mmol/L IPTG进行诱导，同时将温度调整为30℃，诱导48 h。

1.2.6PGL酶活测定碱性果胶酶酶活力检测：取一定量发酵液，8 000 r/min离心10 min，胞外碱性果胶酶即包含于发酵上清液中。碱性果胶酶反应体系为：酶稀释液 20滋L，含 0.2%PGA的甘氨酸-NaOH缓冲液 （0.2 mol/L，0.44 mmol/L的 CaCl2，pH 9.4）2 mL，无活性的酶液为空白对照。碱性果胶酶反应条件为：45℃水浴 15 min，使用 3 mL磷酸溶液（0.03 mol/L）终止反应，235 nm处测定反应物吸光度值。

2结果与讨论

2.1PGL重组菌的构建

重组载体pET-22b（+）/pgl-S的构建流程见图1。将合成短肽整合到pET-22b（+）载体上，随后再将扩增的pgl连接到带有SAP的载体上。

将上海生工合成的双亲短肽基因通过NcoI与NdeI酶切位点与pET-22b（+）连接，得到6个重组质粒pET-22b（+）/S1，pET-22b（+）/S2，pET-22b（+）/ S3，pET-22b（+）/S4，pET-22b（+）/S5和pET-22b（+）/S6。胶回收后，电泳验证结果见图2，条带大小与预期5.6 kb上下吻合。

图1　pET-22b（+）/pgl-S质粒构建流程图Fig.1　Construction of pET-22b（+）/pgl-S

图2　pET-22b（+）/S构建琼脂糖凝胶电泳图Fig.2　Agarose gel electrophoresis of pET-22b（+）/S

以Bacillus sp.WSHB04-02为模板，利用高保真聚合酶Primer Star PCR扩增得到不含自身信号肽的PGL基因pgl。凝胶电泳检测确认为正确长度1.2 kb左右，见图3。

图3　PGL基因琼脂糖凝胶电泳图Fig.3　Agarose gel electrophoresis of PGL gene

将pgl与重组质粒pET-22b（+）/（S1-S6）通过NcoI，XhoI连接，得到PGL基因与双亲短肽SAP连接得到最终的重组载体pET-22b（+）/pgl-S1，pET-22b（+）/pgl-S2，pET-22b（+）/pgl-S3，pET-22b（+）/ pgl-S4，pET-22b（+）/pgl-S5和pET-22b（+）/pgl-S6。整合后的双亲短肽SAP与PGL的N端连接。之所以选择N端连接，是因为之前为了便于纯化，将PGL的C端融合His-Tag，由于改造后蛋白质的二级结构发生变化，致使催化残基结构受到影响，导致表达后的PGL活性降低50%［10］。而N端结果就相对稳定。原始PGL中N端有21个氨基酸的信号肽，信号肽在合成后，将蛋白质携带至内质网上后被切割，为了使双亲短肽不会因此被切割，去除原始PGL中N端的信号肽，与双亲短肽SAP直接相连。对将重组质粒转化E.coli JM109，提质粒，将测序正确的重组载体跑胶见图4。

图4　pET-22b（+）/pgl-S构建琼脂糖凝胶电泳图Fig.4　Agarose gel electrophoresis of pET-22b（+）/pgl-S

2.2重组PGL的表达

将测序正确的pET-22b（+）/pgl-S转化进入E.coli BL21（DE3），种子生长10 h后以3%的接种体积分数加入到发酵培养基TB中，发酵48 h后离心取上清液，将发酵上清液组分进行SDS-PAGE电泳分析，见图5。并检测PGL酶活，见图6。由于加入SAPs的相对分子质量不同，融合之后的蛋白质大小由 43 400依次变为 48 200，51 400，51 600，51 300，51 700和51 500。由图5可知，其中PGLS1、PGL-S2、PGL-S4分泌表达量与改造之前的PGL相比变化不大，PGL-S3、PGL-S5、PGL-S6分泌表达量下降明显。

图5　E.coli BL21（DE3）（pET-22b（+）/pgl-S）发酵上清液SDS-PAGE电泳分析Fig.5　SDS-PAGE analysis of E.coli BL21（DE3）（pET-20b（+）/pgl-S）in supernatant

图6　　重组蛋白质发酵上清酶活Fig.6　Enzyme　activity　of　recombinantPGL　in supernatant

由于PGL已经工业化，在工业应用中为了减少工艺流程降低成本，只提取胞外分泌的PGL。所以本研究主要集中在PGL的胞外分泌表达量。改造后，PGL-S1摇瓶发酵的胞外酶活由129.65 U/mL提高到535.47 U/mL，胞外酶活提高至PGL的4.13倍。虽然之前PGL的罐上产量已达到1 593 U/mL，却是总酶活，其中胞内酶活占了相当大比例［6-7］。再者，毕赤酵母作为单细胞真核生物，具有较完备的基因表达调控机制和对表达产物的修饰能力，非常有利于真核基因的表达，但是PGL基因是来源于原核细胞Bacillus sp.WSHB04-02，不需要毕赤酵母强大的产物修饰能力，加上毕赤酵母表达体系仍存在很多难以克服的问题，比如过程控制复杂，低温诱导耗能高和发酵周期长等，如果能在工艺简单周期短生产成本低的大肠杆菌表达系统中得到高效表达，则能从根本上将PGL的工业化推进一步。

PGL在毕赤酵母中的摇瓶产量达到220 U/mL，3 L罐上优化后提高至1 593 U/mL。PGL在大肠杆菌中罐上优化的胞外酶活为257.8 U/mL，相比摇瓶水平提高了一倍。将改造后的PGL-S1在罐上做扩大培养，其单位酶活很有可能超过之前，潜力巨大。

2.3S1提高胞外PGL酶活水平的机制解析

融合SAP之后PGL-S的酶活有了不同程度的变化。其中以PGL-S1的酶活提高最为显著。但是SDS-PAGE检测分析，却发现PGL-S1的蛋白质表达量反而比之前略有降低，表达量变化不大而酶活却提高了3倍多，由此推出改造后的PGL-S1催化效率大幅提高，即改造后的比酶活提高。利用在线软件（http：//www.expasy.org）计算自组装双亲短肽的疏水性指数（Gravy value）。Gravy value越小表明亲水性越强，反之则说明疏水性越强。自组装双亲结果发现，所有短肽的Gravy value都呈现负值，表明这些短肽总体体现亲水性。SAP1的疏水性性明显高于其他双亲短肽，。已有的研究表明［11］，疏水性是蛋白质发生聚集的主要作用力。大量研究表明［12-13］，寡聚能够加强蛋白质相互作用，固定N、C末端，加强与底物的相互作用，推测由于PGL-S1融合蛋白的表面疏水性得到了提高，因而加强了其与底物聚半乳糖醛酸的相互作用，进而提高了其比酶活。

表2　　双亲短肽疏水性指数Table 2　Gravy value of SAPs

3结语

引入双亲短肽，可改变蛋白质的表面疏水性，增强蛋白质的相互作用，进而提高蛋白质催化效率，促进高效表达。作者通过将6条不同性质的双亲短肽SAP与碱性果胶酶的N端进行融合表达，得到一株高效表达菌株。PGL-S1的酶活大幅提高，仅仅摇瓶产量就提高至出发菌株PGL的4.13倍，达到535.47 U/mL，进一步证明了该策略的高效性。SAP1与碱性果胶酶的融合表达大大提高了酶的催化效率，从而使得碱性果胶酶高效表达。通过进一步的发酵优化，并最终实现工业化有良好前景，可以极大的避免长期以来在工业应用中毕赤酵母表达系统的各种弊端，降低工业成本。

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Fusions of Amphipathic Peptide to the Alkaline Polygalacturonate Lyase from Bacillus sp.WSHB04-02 Improves the Production

WANG Mingxing1，2，LIU Song1，2，LIU Long*1，2，DU Guocheng1，2，CHEN Jian1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Alkaline polygalacturonatelyase（PGL）is one of important industrial enzymes，which was widely used in food，textile and paper industries.In this study，we constructed and expressed six Self-assembling amphipathic peptides（SAPs），whihch were attached to the N terminus of the PGL，to improve the secretory expression of PGL in E.coli.Finally PGL-S1 stood out with enzyme activity improving from 129.65 U/mL to 535.47 U/mL，while the otherenzyme activity weredecreased.There was no obvious change in the extracellular yield of PGL by SDS-PAGE analysis.It indicated that the high enzyme activity was caused by the improving catalytic efficiency.The Grave Value showed that the hydrophobicity of SAP1 was different with the others，which was the main interaction for the accumulation of protein to enhance the interaction between protein and substrate.It was conferred that the improving surface hydrophobicity made a big effect on the catalytic efficiency.PGL-S1has huge potential use for industrial application.

alkalinepolygalacturonatelyase，self-assemblingamphipathicpeptides，efficient secretory overexpression，grave value，catalytic efficiency

TQ 925

A

1673—1689（2016）05—0504—06

2014-09-03

国家“863”计划项目（2012AA022202）；江苏省自然科学基金项目（BK20130132）。
*

刘龙（1980—），男，山东诸城人，工学博士，教授，博士研究生导师，主要从事微生物系统代谢工程及工业酶的分子定向修饰方面的研究。E-mail：longliu@jiangnan.edu.cn