施用畜禽粪便有机肥土壤抗生素抗性基因污染状况

张兰河,王佳佳,,高　敏,仇天雷,韩梅琳,王旭明①

(1.东北电力大学化学工程学院，吉林 吉林　132012；2.北京农业生物技术研究中心，北京　100097)



施用畜禽粪便有机肥土壤抗生素抗性基因污染状况

张兰河1,王佳佳1,2,高敏2,仇天雷2,韩梅琳2,王旭明2①

(1.东北电力大学化学工程学院，吉林 吉林132012；2.北京农业生物技术研究中心，北京100097)

摘要：为研究施用畜禽粪便有机肥农田土壤中抗生素抗性基因的分布状况，采集北京地区9个长期施用有机肥蔬菜基地的温室和大田土壤，对土壤中的抗生素耐药菌和18种抗性基因进行检测分析。结果表明，温室土壤中四环素耐药菌占总菌数的比例显著高于大田土壤(P<0.05)，但温室土壤中氨苄西林、磺胺甲恶唑和环丙沙星耐药菌占总菌数的比例均与大田土壤无显著性差异(P>0.05)。大田土壤和温室土壤中磺胺类抗性基因sulⅠ、sul2和四环素类抗性基因tetL的检出率均为100%。其他抗性基因，如四环素抗性基因tetA、tetA/P、tetC，红霉素抗性基因ermB，以及Ⅰ类整合子(intⅠ1)，温室土壤的检出率均高于大田土壤，这可能与温室土壤有机肥施用量较大有关。

关键词：土壤；有机肥；抗生素耐药菌；抗生素抗性基因

抗生素是20世纪最重要的医学发现之一,为传染病的防治作出了重要贡献。抗生素有刺激动物生长和预防疾病的作用,因此,常以亚治疗剂量长期在饲料中使用[1]。大多数进入动物体内的抗生素不能被完全代谢吸收,约25%～75%的抗生素以母体化合物的形式随粪尿排出体外[2]。因此,动物粪便中的抗生素、耐药菌及抗性基因通过有机肥进入农田土壤中,可能会导致土壤微生物的抗生素抗性增加[3]。

2006年,PRUDEN等[4]首次将抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)作为一种新型的环境污染物提出。不同于传统的化学污染物,ARGs通过整合到一些可移动基因元件上,如质粒、转座子、整合子等,在共生微生物之间、革兰阳性菌和革兰阴性菌之间、致病菌和非致病菌之间相互传播[5]。通过这种基因水平转移(horizontal gene transfer,HGT),ARGs可以在土壤、地下水及各个环境介质中迁移、转化,并很有可能通过食物链最终进入人体,对人类健康造成威胁[6]。更重要的是,ARGs通过基因水平转移,并不依赖其相应的抗生素和耐药菌,这进一步增加了ARGs的传播风险[7]。世界卫生组织(WHO)已将ARGs作为21世纪威胁人类健康的最重大挑战之一,并宣布将在全球范围内对控制ARGs进行战略部署[8]。

为了解有机肥施用对农田土壤中ARGs分布的影响,笔者选择北京地区长期施用有机肥的蔬菜基地,对土壤中抗生素耐药菌和ARGs进行检测分析,旨在为掌握北京地区农田土壤抗生素耐药菌和ARGs的污染状况以及从ARGs角度评估有机肥应用的安全性提供基础数据。

1材料与方法

1.1采样地点与时间

9个采样地点(A～I)分别位于北京市延庆县、海淀区、昌平区、顺义区、平谷区、房山区、大兴区和通州区(图1),均为连续施用有机肥5 a以上的蔬菜生产基地。采样时间为2014年3—4月。采用5点混合采样法分别采集每一采样点的温室和大田表层(5～10 cm)土壤各1 kg。以上采样点的温室每年至少种植2茬蔬菜,施用由畜禽粪便加工而成的有机肥,施用量为60～120 t·hm-2·a-1;大田采样点每年种植1～2茬蔬菜,同样以有机肥作为底肥,但施用量较温室少,一般不超过30 t·hm-2·a-1。在采样点Ⅰ附近采集1份常年不施肥的林地土壤样品作为对照。采集的土样放入装有冰盒的采样箱运回实验室,在24 h内进行抗生素耐药菌计数,剩余样品于-80 ℃条件下保存，用于DNA提取。

图1　采样点分布示意

1.2抗生素耐药菌的计数

称取10 g过2 mm孔径筛的土壤样品,加入到装有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中,于摇床上按200 r·min-1振荡30 min,静置30 min后用10倍稀释法进行系列稀释。取0.1 mL适当倍数的稀释液涂平板,每个稀释度重复3次。细菌总数的计数采用LB固体培养基培养后计数,将已灭菌的LB培养基加入相应的抗生素,不同抗生素的最终浓度:ρ(四环素)为16 mg·L-1[9-11],ρ(氨苄西林)为32 mg·L-1[10-11],ρ(环丙沙星)为4 mg·L-1[10-11],ρ(磺胺甲恶唑)为152 mg·L-1[12]。所有平板于28 ℃下培养2～3 d。选择菌落数量为30～300的平板计算活菌数。

1.3土壤DNA提取

土壤样品总DNA采用The PowerSoil®DNA Isolation Kit(12888-50)(MO BIO Laboratories,Inc)进行提取。DNA提取完毕后,用微量核酸蛋白质分析仪(Nanodrop)检测含量及纯度，A260/A280值在1.8～2.0之间,表明用试剂盒提取的DNA纯度较高。

1.4ARGs的PCR检测

对3种β-内酰胺类ARGs(blaCARB-4、blaSPM-1、blaTEM*)、1种喹诺酮类ARGs(qnrS)、3种磺胺类ARGs(sulⅠ、sul2、dfrA1)、9种四环素类ARGs(tetA、tetA/P、tetC、tetE、tetL、tetW、tetG、tetX、tetY)、1种红霉素类ARGs(ermB)和1种Ⅰ类整合子(intⅠ1)进行检测。以上ARGs的引物及退火温度见表1[13-22]。

PCR过程:预变性温度为94 ℃,时间3 min;然后94 ℃变性30 s,不同温度(T)退火30 s,72 ℃延伸30 s,循环30次;72 ℃保持5 min;最后4 ℃保温。反应体系如表2所示。

PCR产物检测:用w为1%琼脂糖凝胶电泳检测,用核酸染料GelRed染色,每5 μL的RCR原液与1 μL的6倍缓冲液混合加入胶内(即6 μL Marker Trans2K plus检测琼脂糖凝胶),恒压110 V,跑胶 40 min,Alphalmager HP凝胶成像分析系统进行拍照检测。

2结果与讨论

2.1农田土壤抗生素耐药菌的数量

选择4种常见的抗生素(四环素、氨苄西林、环丙沙星和磺胺甲恶唑)耐药菌进行分析检测[23-24]。大田土壤和温室土壤中抗生素耐药菌活菌数如表3所示。由表3可知，温室土壤中四环素耐药菌和氨苄西林耐药菌数量显著高于大田土壤(P<0.05),但环丙沙星和磺胺甲恶唑耐药菌数量在温室土壤和大田土壤之间无显著性差异(P>0.05)。由于大田和温室土壤中可培养细菌总数不同,所以单纯从绝对数量上比较不足以全面反映大田和温室土壤中抗生素耐药菌的差别。

表1ARGs检测的PCR引物

Table 1Primers for ARGs detection with PCR

类型目标基因5'端序列3'端序列退火温度/℃参考文献β-内酰胺类抗性基因blaCARB-4ACCGTATTGAGCCTGATTTAATTGAAGCCTGTGTTTGAGC55[13]blaSPM-1CTAAATCGAGAGCCCTGCT-TGCCTTTTCCGCGACCTTGATC53[14]blaTEM*TCCGCTCATGAGACAATA-ACCTTGGTCTGACAGTTAC-CAATGC55[15]喹诺酮类抗性基因qnrSACGACATTCGTCAACTGCAATAAATTGGCACCCTGTAGGC53[16]磺胺类抗性基因sulⅠTTCGGCATTCTGAATCTCACATGATCTAACCCTCGGTCTC53[17]sul2CGGCATCGTCAACATAACCTTGTGCGGATGAAGTCAGCTC66[18]dfrA1AGCATTACCCAACCGAAAGTTGTCAGCAAGATAGCCAGAT60[19]四环素类抗性基因tetAGGCGGTCTTCTTCATCATGCCGGCAGGCAGAGCAAGTAGA64[18]tetA/PCTTGGATTGCGGAAGAAGAGATATGCCCATTTAACCACGC55[20]tetCGCTGTAGGCATAGGCTTGGTGCCGGAAGCGAGAAGAATCA64[18]tetEGTTATTACGGGAGTTTGTT-GGAATACAACACCCACAC-TACGC55[20]tetLTCGTTAGCGTGCTGTCATTCGTATCCCACCAATGTAGCCG55[20]tetWGAGAGCCTGCTATATGC-CAGCGGGCGTATCCACAATGTTA-AC60[21]tetGGCTCGGTGGTATCTCTGCTCAGCAACAGAATCGGGAACAC55[21]tetXCAATAATTGGTGGTGGACCCTTCTTACCTTGGACATCCCG58[21]tetYATTTGTACCGGCAGAG-CAAACGGCGCTGCCGCCATTATGC55[21]红霉素类抗性基因ermBGATACCGTTTACGAAATTGGGAATCGAGACTTGAGTGTGC58[22]Ⅰ类整合子intⅠ1CTGGATTTCGATCACG-GCACGACATGCGTGTAAAT-CATCGTCG60[20]

表2PCR反应体系

Table 2PCR reaction system

试剂每管用量/μL2×TransStartTMFastPfuPCRSuperMix12.5上游引物(10μM·μL-1)1下游引物(10μM·μL-1)1ddH2O8.5模板体积1总体积25

从抗生素耐药菌占可培养细菌总数的比例来看,大田土壤中四环素耐药菌占总菌数比例的平均值为1.91%,显著低于温室土壤(P<0.05)。大田土壤中氨苄西林、环丙沙星、磺胺甲恶唑耐药菌占总菌数的比例分别为4.90%、1.50%和20.47%,均与温室土壤中这几种抗生素耐药菌的比例无显著性差异(P>0.05)。林地土壤样品中四环素、氨苄青霉素、环丙沙星和磺胺甲恶唑的耐药菌数量分别占总菌数的0.5%、0.8%、0.7%和7.9%,远低于大田和温室土壤中耐药菌的比例,这说明人工施肥后增加了土壤中抗生素耐药菌的比例。

表3温室土壤与大田土壤中抗生素耐药菌数量及占总菌数的比例

Table 3Number of antibiotics resistant bacteria and percentage of antibiotics resistant bacteria to total bacteria in greenhouse soil and in field soil

耐药菌类型 土壤类型活菌数(以干重计)耐药菌占总菌数的比例平均值1)/g-1标准差1)/g-1显著性(P)2)平均值/%标准差/%显著性(P)2)四环素耐药菌大田8.47×1041.33×1050.0031.912.270.048温室6.56×1055.18×1056.646.83氨苄西林耐药菌大田2.21×1052.52×1050.0174.904.000.260温室6.99×1055.29×1057.175.16环丙沙星耐药菌大田6.19×1046.69×1040.1301.500.890.910温室2.45×1052.37×1051.571.29磺胺甲恶唑耐药菌大田5.20×1055.35×1050.18020.4712.470.470温室3.89×1065.10×10615.736.55

1)以CFU计。2)为同种耐药菌类型的大田与温室土壤间某指标的差异显著性分析结果。

以上研究结果表明,无论是否施用有机肥,土壤中磺胺甲恶唑耐药菌数量和占总菌数比例远高于四环素、氨苄西林和环丙沙星耐药菌。长期施用有机肥的农田土壤中,四环素、氨苄西林、环丙沙星、磺胺甲恶唑耐药菌占总菌数的比例远高于不施肥的林地土壤。由于温室的有机肥施用量高于大田土壤,可能会造成温室土壤中可培养四环素耐药菌比例增高。

2.2土壤中ARGs的检测结果

大田土壤检出13种ARGs和1种Ⅰ类整合子intⅠ1(表4)。磺胺类抗性基因sulⅠ、sul2和四环素抗性基因tetL检出率为100%,其中sulⅠ、sul2属于目标分流抗性基因,通过突变或者酶基因的缺失使抗生素无法作用于目标酶[25-26],tetL属于外排泵基因。四环素类编码核糖体保护蛋白基因tetW也有很高的检出率,为77.8%。4个外排泵机理的四环素抗性基因tetA、tetA/P[27]、tetC、tetG和1个酶修饰基因tetX也有不同程度的检出[28]。β-内酰胺类抗性基因blaCARB-4、blaTEM*、红霉素类抗性基因ermB和磺胺类抗性基因dfrA1也有一定的检出。Ⅰ类整合子intⅠ1的检出率为22.2%。

温室土壤检出14种ARGs和1种Ⅰ类整合子intⅠ1(表5)。磺胺类抗性基因sulⅠ、sul2和四环素抗性基因tetL检测率为100%。磺胺类抗性基因dfrA1、四环素外排泵基因tetG和酶修饰基因tetX也有很高的检出率,分别为77.8%、77.8%和66.7%。3个外排泵机理的四环素抗性基因tetA、tetA/P、tetC、tetG和1个编码核糖体保护蛋白基因tetW,以及红霉素类抗性基因ermB也有较高的检出率。β-内酰胺类抗性基因blaCARB-4、blaTEM*和喹诺酮类抗性基因qnrS也有检出,但检出率较低。Ⅰ类整合子intⅠ1检出率为55.6%。

表4大田土壤中抗性基因的检测结果

Table 4ARGs detected in field soil

样品β-内酰胺类抗性基因喹诺酮类抗性基因磺胺类抗性基因四环素类抗性基因红霉素类抗性基因Ⅰ类整合子blaCARB-4blaSPM-1blaTEM*qnrSsulⅠsul2dfrA1tetAtetA/PtetCtetEtetLtetWtetGtetXtetYermBintⅠ1A----++-----++-----B----++-----++-----C----++-----++++-+-D----+++----++++-+-E----++-----++-----F----++-----+-+--+-G--+-++-----+------H+-+-++++-+-++++-++I----++++++-++++--+CK------------------检出率/%11.1022.2010010033.322.211.122.2010077.855.644.4044.422.2

+代表被检出,-代表未被检出。A～I分别为取自北京市延庆县、海淀区、昌平区、顺义区、平谷区、房山区、大兴区和通州区蔬菜基地的大田土壤样品;CK为对照(林地)土壤样品。

表5温室土壤中抗性基因的检测结果

Table 5ARGs detected in greenhouse soil

样品β-内酰胺类抗性基因喹诺酮类抗性基因磺胺类抗性基因四环素类抗性基因红霉素类抗性基因Ⅰ类整合子blaCARB-4blaSPM-1blaTEM*qnrSsulⅠsul2dfrA1tetAtetA/PtetCtetEtetLtetWtetGtetXtetYermBintⅠ1A----++++++-+-++-++B----++-----++-----C----++++-+-++++---D----+++-++-++++-++E----++-----++-----F----++++-+-+-++-++G--+-+++----+-++-++H+-+-++++++-++++-++I---++++-+--+-+----CK------------------检出率/%11.1022.211.110010077.844.444.455.6010055.677.866.7055.655.6

+代表被检出,-代表未被检出。A～I分别为取自北京市延庆县、海淀区、昌平区、顺义区、平谷区、房山区、大兴区和通州区蔬菜基地的温室土壤样品;CK为对照(林地)土壤样品。

从表4～5还可看出,未施用有机肥的林地土壤(对照)18种ARGs的检测结果均为阴性,而施用有机肥的大田土壤和温室土壤中分别检测出14和15种抗性基因,说明有机肥施用可能是造成农田土壤ARGs污染的原因之一。

此外,无论是温室还是大田土壤,磺胺类抗性基因sulⅠ、sul2的检出率均为100%,表明它们在土壤环境中相当稳定,应引起特别关注。这一结果与可培养耐药菌中磺胺甲恶唑耐药菌的比例较高相一致(表3)。四环素类3种抗性机制(外排泵抗性机制、核糖体保护蛋白机制和酶修饰蛋白机制)的抗性基因在大田土壤和温室土壤中均被不同程度检出,且检出率差别不大,说明农田土壤中有机肥施用对不同机制四环素抗性基因的存在影响不大。磺胺类和四环素类抗生素是我国养殖业常用的抗生素[24]。通过粪肥施用,农田土壤中这2类抗生素的耐药菌和抗性基因分布较为广泛。尤其是磺胺类抗生素为人工合成的一种抗菌药物,微生物不能合成,因此土壤微生物获得的磺胺抗性主要是由于进入土壤中的磺胺类抗生素对土著微生物产生了选择压,诱导磺胺抗性基因的产生;或者是进入土壤中的磺胺抗性基因通过横向转移使土著微生物获得了磺胺抗性。

从ARGs种类的分布可以看出,大田土壤和温室土壤中ARGs的种类区别不大,仅喹诺酮类抗性基因qnrS只能在温室土壤检出。从各种ARGs的检出率可以看出,温室土壤中ARGs检出率比大田土壤高,这可能与有机肥施用量有关。温室由于每年种植多茬蔬菜,施肥量远大于大田,因此造成温室土壤ARGs检出率高于大田土壤。温室土壤中Ⅰ类整合子intⅠ1检出率是大田土壤的2倍多。Ⅰ类整合子intⅠ1能够控制细菌的外源性基因表达,而被认为是在ARGs传播过程中起到重要作用的一类抗性基因[23,28]。由于Ⅰ类整合子intⅠ1在温室土壤中具有较高的检出率,因此,相比大田土壤,温室土壤中的ARGs可能更容易横向转移,造成更大的生态风险。

粪肥的施用畜禽粪便不但能增加受纳农田土壤中某些抗生素耐药菌的数量,而且可增加多种ARGs的检出率,具有潜在的环境健康风险。因此,从ARGs的角度去评估有机肥的生态安全性是十分必要的。其次,还应从ARGs消减的角度加强有机肥发酵工艺的研究,以降低ARGs的环境传播风险[29]。

3结论

长期施用有机肥会增加土壤中可培养耐药菌丰度,同样会增加ARGs检出率。温室土壤中四环素耐药菌占总菌数的比例约是大田土壤的3倍。温室土壤和大田土壤之间氨苄西林耐药菌、环丙沙星耐药菌和磺胺甲恶唑耐药菌占总菌数的比例无显著性差异。磺胺类抗性基因sulⅠ、sul2和四环素抗性基因tetL在大田土和温室土的检出率都为100%。其他抗性基因,如四环素抗性基因tetA、tetA/P、tetC,红霉素抗性基因ermB,以及Ⅰ类整合子(intⅠ1)均是温室土壤的检出率高于大田土壤。

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(责任编辑： 陈昕)

收稿日期：2015-06-10

基金项目：家禽产业技术体系北京市创新团队专项资金(CARS-PSTP)；北京市农林科学院科技创新能力建设专项(KJCX2014302)

通信作者①E-mail: wangxuming@baafs.net.cn

中图分类号：X53

文献标志码：A

文章编号：1673-4831(2016)04-0664-06

DOI：10.11934/j.issn.1673-4831.2016.04.023

作者简介：张兰河(1971—),男,黑龙江双鸭山人,教授,博士,主要从事环境生物技术方面的研究。E-mail: zhanglanhe@163.com

Pollution of Antibiotics Resistant Genes in Farmland Amended With Livestock Organic Manure.

ZHANG Lan-he1, WANG Jia-jia1,2, GAO Min2, QIU Tian-lei2, HAN Mei-lin2, WANG Xu-ming2

(1.College of Chemical Engineering, Northeast Dianli University, Jilin 132012, China；2.Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijing 100097, China)

Abstract:In order to investigate distribution of antibiotics resistant genes (ARGs) in farmland soil amended with organic manure, soil samples from greenhouses and fields in nine vegetable production bases in the suburbs of Beijing were collected for analysis of antibiotics resistant bacteria and 18 types of ARGs. The analysis shows that the soil samples from greenhouses were higher than those from fields in proportion of tetracycline resistant bacteria to total bacteria in count (P<0.05), and little difference was found between the two groups of soil samples in proportion of ampicillin, sulfa methoxazole and ciprofloxacin resistant bacteria to total bacteria in count. Sulfanilamide resistant genes (sulⅠ and sul2) and tetracycline resistance genes (tetL) were detected in all the soil samples, whereas tetracycline resistant genes (tetA, tetA/P and tetC), erythromycin resistant genes (ermB), and I integron (intⅠ1) were detected with a higher detectable rate in greenhouse soil than in field soil, which may be associated with more organic manure applied to the former than to the latter.Key words:soil;organic manure;antibiotics resistant bacteria;antibiotics resistant genes