补肾祛痰活血汤对缺血再灌注损伤大鼠Occludin、ZO-1蛋白的调节作用

杨　　涛，王净净*，陶　　琳，钟乔青，吴彬才

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.衡阳市江东中医院，湖南 衡阳 421002）

补肾祛痰活血汤对缺血再灌注损伤大鼠Occludin、ZO-1蛋白的调节作用

杨涛1，2，王净净1*，陶琳1，钟乔青1，吴彬才1

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.衡阳市江东中医院，湖南 衡阳 421002）

目的 观察补肾祛痰活血汤对预处理脑缺血再灌注损伤的大鼠脑组织水肿、血脑屏障通透性及损伤区咬合蛋白（Occludin）、闭锁小带蛋白（zonula occludens-1，ZO-1）的影响。方法 SD成年雄性大鼠50只，按随机数字表法分为正常组、模型组、假手术组、治疗组、对照组，每组10只。治疗组给补肾祛痰活血汤、对照组给消栓通络胶囊，正常组、模型组、假手术组给与相应量的双蒸馏水。采用线栓法复制脑缺血再灌注损伤模型，72 h后，干湿重法测定脑含水量反映脑水肿程度，用免疫组织化学方法测定损伤区Occludin、ZO-1蛋白的表达量，并对各结果进行相关性分析。结果 与正常组、假手术组比较，模型组、治疗组、对照组72 h时间点大鼠脑组织含水量较正常组、假手术组要增高一些，脑组织损伤区周围Occludin、ZO-1蛋白表达明显降低（P＜0.01）。脑组织含水量与脑组织损伤程度正相关，脑组织损伤区周围Occludin、ZO-1蛋白与脑组织损伤程度呈负相关。结论 补肾祛痰活血汤对缺血性脑损伤发生后损伤区Occludin、ZO-1蛋白含量降低有抑制作用，抑制血脑屏障通透性增高，减轻脑水肿形成。

补肾祛痰活血汤；咬合蛋白；闭锁小带蛋白；脑缺血再灌注损伤模型；制附子；桂枝；熟地黄

〔Abstract〕Objective To investigate the effect of Bushen Huoxue decoction on rat brain edema，blood brain barrier permeability，damage zone occlusal protein（occludin），zonula occludens（ZO-1）proteinin pretreatment ischemia reperfusion injury rats.Methods Fifty SD adult male rats were divided into normal group，model group，sham operation group，treatment group，control group according to the random number table method，10 rats in each group.The treatment group was given Bushen Huoxue decoction，while the control group was given Xiaoshuan Tongluo capsule.The normal group，model group，sham operation group were given the corresponding double distilled water.The model of cerebral ischemia-reperfusion injury was established by suture method.After 72 hours，the brain water content was determined by dry wet weight method to reflect the degree of brain edema.The damage zone occludin and ZO-1 protein expression were tested by immunohistochemical method，and the results were analyzed by correlation analysis.Results Compared with the normal group and sham operation group，the brain tissue water content in rats at 72 h of model group，treatment group and control group was increased，the occludin and ZO-1 protein expression in brain tissue damage zone were significantly decreased（P＜0.01）.The water content of brain tissuewas positively correlated with the degree of brain tissue injury，ZO-1 and occludin protein were negatively correlated with the degree of brain tissue injury.Conclusion Bushen Quyu Huoxue decoction can inhibite the decrease of occludin and ZO-1 protein，inhibite the blood brain barrier permeability and relieve brain edema formation.

〔Keywords〕Bushen Huoxue decoction；occludin；zonula occludens protein；cerebral ischemia reperfusion injury model；prepared monkshood；Cassia Twig；prepared rehmannia root

脑卒中是神经系统较为常见疾病之一，是死亡较高的三大疾病之一。在脑血管疾病中，最常见的是缺血性脑卒中，约占60%～80%。迅速重建梗塞区域血流供应能显著改善缺血性脑卒中预后［1］。中医药对急性期及恢复期脑梗所致的神经功能缺损的有改善的作用。常以益气活血通络、化痰通腑为治疗法则，较少提及温阳治法。本研究将温阳通络为主的补肾祛痰活血汤作用于预处理脑缺血再灌注损伤大鼠，探讨其预防保护作用与机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物健康雄性SPF级SD大鼠50只，鼠龄6-8周，体质量180～220 g，由湖南斯莱克景达动物有限公司提供，动物使用许可证编号：SYXK（湘）2013-0005。

1.1.2受试药物补肾祛痰活血汤：由制附子10 g（先煎），桂枝10 g，熟地黄10 g，山茱萸10 g，山药10 g，巴戟天10 g，肉苁蓉10 g，石菖蒲10 g，远志10 g，黄芪30 g，水蛭3 g，当归10 g，川芎10 g，丹参10 g，牡丹皮10 g，桃仁10 g，防风10 g，刺蒺藜10 g，地龙10 g，甘草5 g等23味药组成，以上饮片由湖南中医药大学中医附属第一医院中药房提供，228 g/剂，加水煎煮浓缩为114 mL，含生药2 g/mL。消栓通络胶囊：由川芎，丹参，黄芪，泽泻，三七，槐花，桂枝，郁金，木香，冰片，山楂11味药组成（吉林省东北亚药业股份有限公司，国药准字Z10940067，0.37 g/粒），6粒溶散于114 mL双蒸水，含生药0.019 5 g/mL。

1.1.3试剂及仪器一抗试剂Rabbit-anti-Occ（Cat Number bs10011R、Lot类型AD081219），一抗Rabbitanti-ZO-1（Cat Number bs1329R、Lot类型AD120439），均购自北京奥博森生物技术有限公司；二抗试剂通用型（批号：K152318A），购自北京中杉金桥，Motic B5显微摄像图像分析系统 （麦克奥迪实业集团公司）；S2-93自动双重纯水蒸馏器 （上海亚荣生化仪器厂）；Shandon325型石蜡切片机（英国Shandon公司产）；LEICA DM LB型双目显微镜 （德国LEICA公司产）。

1.2方法

1.2.1动物分组及造模［2］SD大鼠经过适应性喂养1周后，按随机数字表随机分为正常组、假手术组、模型组、治疗组、对照组，共5组，每组10只。实验组、对照组、模型组造模，将SD大鼠麻醉后固定于操作台，从其右颈部逐层切开，将颈总动脉分离出来，分离出颈内动脉、颈外动脉，将颈总动脉近分支端用血管夹钳夹，颈外动脉结扎，近颈总动脉段将颈内动脉斜形切开，将3.0的鱼线插入大脑中动脉，进行栓塞，用线打结固定线栓，于伤口处覆盖湿润生理盐水纱布，1.5 h后，将线栓拔出，逐层缝合，伤口络合碘消毒，1 h后再进行评分。模型评定：0分为肢体活动正常；1分为提尾悬空后不能伸展对侧前爪；2分为行走向对侧转圈；3分为行走困难，并向对侧倾倒；4分为不能自发行走或昏迷。1-3分的纳入实验：模型组2分的7只，3分的1只。治疗组2分的5只，3分的3只，对照组1分的1只，2分的7只。假手术组造模，大鼠麻醉后固定于操作台，从其右颈部逐层切开，将颈总动脉分离出来，分离出颈内动脉、颈外动脉，颈总动脉后，颈内动脉不切开，不插入线栓，立即逐层缝［3］。正常组未做处理。

1.2.2药物干预正常组、假手术组和模型组按11 ml/（kg·d）的双蒸馏水灌胃给药。治疗组以补肾祛痰活血汤浓缩成114 mL，按23 g/（kg·d）灌胃给药［4］。对照组给予消栓通络胶囊，将6粒胶囊溶散于114 mL双蒸水，按0.224 g/（kg·d）给药。给药3 d后，将治疗组、对照组、模型组造模，假手术组按相关方案处理，造模后第2天各组灌胃相应的双蒸水或药物，3 d后，将所有实验大鼠进行标本取材及检测。

1.2.3脑水肿程度测定采用干湿重法测定脑组织含水量。各组取8只大鼠，水合氯醛腹部注射麻醉后，尾静脉按体质量注射EB，运用2%EB按0.2 mL/100 g注射，身体及双眼变蓝1 h，心内注入生理盐水，直到右心耳漏出清凉液体，迅速断头，取出左侧前端大脑皮质100 mg，用电子天平称其湿重后，置入60℃烤箱中烤干24 h至恒重。脑组织含水量=（湿重—干重）÷湿重×100%。

1.2.4免疫组织化学方法检测相关因子的表达将所取的左侧大脑组织入4%多聚甲醛固定24 h以上，递度乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚4～5 μm，铺片，烤片，染色，封片，干后镜下观察并显微镜采图。切片脱蜡，水化组织切片，3%双氧水阻断内源性过氧化物酶，入PBS修复液置微波炉修复抗原，冷至室温，PBS冲洗，加1∶100一抗Rabbit-anti-Occludin/Rabbit-anti-ZO-1，每片50 μL，4°C过夜，PBS漂洗，滴加试剂1聚合物捕助剂每片50 μL，滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗，DAB显色，镜下控制，水洗，苏木精复染，脱水、透明、封片，镜下观察并拍照。

1.3统计学处理

2结果

2.1脑组织含水量

正常组、假手术组、治疗组、对照组与模型组比较，正常组与假手术组没有明显差异（P＞0.05），治疗组、对照组各组脑含水量较模型组明显减低 （P＜0.01）。治疗组较对照组能更好减轻脑组织水肿（P＜0.01）。结果见表1。

2.2HE染色结果

实验大鼠左侧大脑海马C2区，正常组与假手术组胞核成圆行，核质分布均匀，核仁明显，清晰圆润。模型组胞核固缩，塌陷，核质不清晰，部分细胞坏死消失，胶质细胞增生，较其他组坏死比例明显增加。治疗组较对照组坏死细胞减少。补肾祛痰活血汤较消栓通络胶囊能更好地保护脑组织，减少脑细胞破坏。见图1。

图1大鼠脑组织染色形态光镜图（HE×400）

2.3各组Occludin与ZO-1表达的比较

实验大鼠左侧大脑海马C2区Occludin阳性表达为棕黄色。正常组、假手术组胞质强阳性表达，胞核弱阳性表达，细胞外组织表达强阳性。模型组胞核表达弱阳性，细胞外表达弱阳性，少部分细胞核呈阳性表达，坏死的细胞核固缩。治疗组、对照组胞核弱阳性表达，胞外突起表达呈中阳性，。实验大鼠左侧大脑海马C2区ZO-1阳性表达为棕黄色。正常组、假手术组胞核胞质均有表达，胞外阳性表达丰富，治疗组部分细胞坏死。模型组ZO-1海马部位细胞无表达，胞外弱阳性，较多细胞坏死。对照组、治疗组ZO-1表达呈中阳性，部分细胞坏死，与正常组和假手术组比较，模型组Occludin、ZO-1光密度值均下降 （P＜0.01）；与模型组比较，治疗组与对照组Occludin、ZO-1光密度值均升高（P＜0.01），且治疗组优于对照组（P＜0.01）。说明补肾祛痰活血汤较消栓通络胶囊能更好调节Occludin、ZO-1的表达，减少脑组织损伤。见表1，图2-3。

图2大鼠脑组织Occludin的表达光镜图（免疫组化×400）

图3大鼠脑组织ZO-1的表达光镜图（免疫组化×400）

3讨论

模型鼠大脑局部梗塞后，血脑屏障功能破坏，脑组织功能受损伤。病灶中心区脑组织发生损害多为不可逆性，其周围半暗带区神经组织损害可逆，尽早解除梗塞，尤为重要。恢复血流可缩小甚至消除梗塞，改善脑组织功能，促进神经再生，还能多环节干预包括神经细胞凋亡在内的级联反应［5］。血脑屏障是脑毛细血管内皮细胞、其间的紧密连接、基底膜下星型胶质细胞周足及基底膜构成的屏障［6］。紧密连接是维持血脑屏障功能与的结构重要基础［7］。紧密连接〔Tihgt junction.TJ〕存在于细胞间，对于细胞旁路途径（屏障功能）的调控具有重要意义。occludin蛋白是构成TJ的重要跨膜蛋白，对其组成和屏障功能维持起到了重要作用［8］。ZO-1表达水平的高低与血脑屏障的通透性密切相关［9］，occludin及 ZO-1蛋白表达的变化可能是血脑屏障通透性改变的分子基础之一。ZO-1蛋白的变化幅度高于Occludin蛋白，位于细胞质内的 ZO-1蛋白对缺血再灌注的刺激更为敏感，偏向于调节作用，而跨膜蛋白Occludin则更偏向于维持TJ形态和功能［10］。Occludin存在于脑血管内皮细胞间的TJ处，对于维持BBB的生理功能具有重要作用。Occludin的羧基端与ZO-1的PDz结构域相连，ZO-1作为细胞骨架的连接者，协助Occludin与细胞骨架的联系，维持内皮细胞间的连接和细胞信号的传导等。在某些病理因素的参与下，TJ的功能下降，细胞间的通透性增高，而Occludin是衡量TJ功能变化的重要指标之一，TNF-α影响BBB的靶位点可能存在于对Occludin的mRNA的转录与蛋白质的表达有调控作用［11］。笔者将大鼠进行脑缺血再灌注，运用在王净净老师经验方化瘀通络复步汤［12］的基础上，经王老师指导拟定的补肾祛痰活血汤进行治疗。本方针对阳化气，阴成形设计。阳虚不化湿，湿聚成痰，痰瘀管壁，日久瘀而不通，而发中风，即西医所说的缺血性脑卒中。从补肾入手，本虚标实，肾为先天之本，故用制附子为君药，附子可温通阳，暖命门，温坎水，破阴凝，可谓是扶阳第一要药。桂枝、巴戟天、肉苁蓉为臣药，温阳化气，痰瘀得温而化，熟地、山茱萸为佐药，佐助附子，善补阳者，阴中求阳。石菖蒲、远志祛痰，水蛭、当归、川芎、丹参、桃仁活血祛瘀，防风、刺蒺藜有祛风之效，多靶点、多系统、全方位治疗。从现代药理学来看：附子有消炎镇静的作用。桂枝有抗炎抗菌的作用，能解除毛细血管的收缩，降低血浆纤维蛋白原含量，降低血浆粘度，有助于血细胞表面电荷的充分暴露和变形活动，从而使全血黏度降低，改善组织循环，使病变组织逆转修复。当归、川芎、桃仁、具有扩张血管、增强脑血流量、改善脑部血液循环、改善血液流变性、降低血脂、改善脑缺氧及促进神经功能恢复等作用［13］，刺蒺藜可降压，红景天可以提高血红蛋白与氧的结合能力。实验研究表明，Occludin与ZO-1蛋白表达越强，血脑屏障损伤越少，补肾祛痰活血汤能提升缺血性脑损伤区脑组织Occludin与ZO-1蛋白的表达，保护血脑屏障的紧密连接，改善血脑屏障的通透性。补肾祛痰活血汤对紧密连接关系密切的ZO-1、Occludin蛋白有较好调控作用，具体作用与调控机制还有待进一步研究，为治疗缺血性脑卒中患者研究提供更多的思路，为临床治疗带来新的启示。

表1各组脑组织含水量、Occludin及ZO-1的比较　　（±s）

表1各组脑组织含水量、Occludin及ZO-1的比较　　（±s）

注：与假手术组比较△△P＜0.01；与模型组比较▲▲P＜0.01；与对照组比较##P＜0.01。

组别　n　　脑组织含水量（%）　Occludin光密度值　ZO-1光密度值正常组　8　0.805 0±0.009 3　0.336 2±0.020 7　0.515 0±0.017 7假手术组　8　0.802 5±0.012 8　0.335 0±0.020 0　0.516 0±0.026 1模型组　8　0.888 7±0.012 5△△　0.173 8±0.020 7△△　0.281 3±0.025 9△△治疗组　8　0.835 0±0.009 3△△▲▲##　0.260 0±0.011 9△△▲▲##　0.441 3±0.025 3△△▲▲##对照组　8　0.853 7±0.010 6△△▲▲　0.220 0±0.0119△△▲▲　0.330 0±0.016 0△△▲▲F值　85.771　132.224　104.361 P值　0.000　0.000　0.000

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（本文编辑杨瑛）

The Effect of Bushen Huoxue Decoction through Regulating ZO-1 and Occludin Proteins in Ischemia Reperfusion Injury Model Rats

YANG Tao1，2，WANG Jingjing1*，TAO Lin1，ZHONG Qiaoqing1，WU Bincai1
（1．Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；2.Jiangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine，Hengyang，Hunan 421002，China）

R285.5；R278

B

10.3969/j.issn.1674－070X.2016.08.006

2016-03-15

衡阳市科学技术局科技计划发展项目项目编号（2014KJ63）。

杨涛，男，在读硕士研究生，副主任医师，研究方向：中西医结合脑血管疾病防治。

*王净净，男，教授，博士研究生导师，E-mail：wangjingjing1954@163.com。