微小核糖核酸-21在乳腺癌中的表达及其与乳腺癌侵袭转移的关系分析

甄时建



微小核糖核酸-21在乳腺癌中的表达及其与乳腺癌侵袭转移的关系分析

甄时建

【摘要】目的 探讨微小核糖核酸-21（miR-2）在乳腺癌中的表达及其与乳腺癌侵袭转移的关系。方法 选取2014年2月至2016年2月湖南中医药高等专科学校附属第一医院收治的65例乳腺癌患者为观察组，其中存在淋巴结转移39例，未发生淋巴结转移26例；并以同期行健康体检的65例健康成人及收治65例乳腺良性病变患者作为对照A组与对照B组。分别对采集的血清标本与乳腺细胞依次开展miR-21临床检验，评估其在乳腺癌中的表达并分析与乳腺癌侵袭转移的相关性。结果 观察组患者的miR-21相对表达量明显高于A组与B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；观察组中发生淋巴结转移的患者 miR-21相对表达量明显高于无淋巴结转移患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；MCF-7、MDA-MB-231与 MDA-MB-468乳腺癌细胞的 miR-21相对表达量均明显高于 HBL-100组，且 MDA-MB-231与MDA-MB-468侵袭性乳腺癌细胞的miR-21相对表达量明显高于MCF-7非侵袭性乳腺癌细胞，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；转染miR-21抑制剂的MDA-MB-231侵袭性人乳腺癌细胞迁移至小室细胞数量与穿过基质胶细胞数量均明显低于A组乳腺细胞，组间比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论 乳腺癌患者的miR-21呈高表达状态，其表达水平同癌细胞侵袭转移具有相关性，抑制miR-21水平有利于控制肿瘤细胞转移。

【关键词】肿瘤标记；乳腺癌；微小核糖核酸-21；肿瘤转移

近年来，病理生物学在对多种肿瘤及病毒感染性疾病的研究中发现了微小核糖核酸-21（miR-2），该物质是一种非编码的小分子核糖核酸（RNA），可通过调节靶基因表达进而影响细胞增殖、分化及转移［1-2］。既往研究表明，肿瘤细胞微小核糖核酸（miRNA）呈高度稳定状态存在于肿瘤患者血清中，提示特异性miRNA可作为肿瘤标志物之一［3］。本研究就 miR-21在乳腺癌中的表达及其与乳腺癌侵袭转移的关系进行探讨，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年2月至2016年2月我院收治的65例乳腺癌患者为观察组，本组患者均在手术治疗前开展血清标本收集，且均未接受过放疗、化疗及免疫等治疗措施，并以同期行健康体检的65名健康成人及收治65例乳腺良性病变患者作为对照A组与对照B组。观察组患者年龄35～66岁，平均（50±5）岁，其中存在淋巴结转移 39例，未发生淋巴结转移26例；A组健康体检者年龄32～65岁，平均（51±5）岁；B组患者年龄33～67岁，平均（51±5）岁。3组受试对象一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，且均于试验前签署了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 CFX96定时定量基因扩增仪（美国Bio-rad公司）；miRNA提取试剂盒、miR-21抑制剂（美国Omega）；基质胶（美国BD公司）；脂质体转染试剂盒与TRIzol试剂盒（美国Invitrogen公司）；TaqMan miRNA定量分析试剂盒（美国ABI公司）；侵袭小室与培养基（美国Corning公司）；整合SV40基因的乳腺上皮细胞（HBL-100）、MCF-7人乳腺癌细胞、MDA-MB-231人乳腺癌细胞及MDAMB-468人乳腺癌细胞（ATCC）。

1.2.2 细胞培养方法 采用高糖培养基培养HBL-100人乳腺上皮细胞，RPMI 1640培养基培养MCF-7非侵袭性人乳腺癌细胞，L15培养基培养MDA-MB-231 与MDA-MB-468侵袭性人乳腺癌细胞。上述培养基中应均加双抗、10%胎牛血清与5% CO2，培养箱温度设定为37 ℃。

1.2.3 检测方法 采用实时定量荧光聚合酶链反应检测各组样本 miR-21的表达情况，先应用 TRIzol试剂提取总RNA，再根据miRNA提取试剂盒操作要求测定miR-21。将3 μl逆转录酶加入10 ng总RNA中进行逆转录，16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃5 min。将获取产物稀释150倍后与2 μl TaqMan引物混合，95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共计40个循环。血清样本的miRNA水平以cel-miR-39作为对照，表达采用2－△ct计算；细胞miRNA水平以 U6 小核核糖核酸（snRNA）作为对照组，采用2－△△ct计算。

1.2.4 乳腺肿瘤细胞侵袭转移的测定 接种 MDAMB-231侵袭性人乳腺癌细胞后24 h，观察其贴壁细胞数量并适时给予转染，根据脂质体转染试剂盒相关操作指示将miR-21抑制剂转染于MDA-MB-231侵袭性人乳腺癌细胞中。48 h后制备细胞悬液，并开展微孔滤膜培养小室及双室联合培养系统（Transwell）小室上室接种。根据其指示说明将10%FBS溶液与培养基加入侵袭小室下室，再分别加入细胞悬液。以37 ℃培养1～2 d，再应用电子显微镜进行观察，有细胞穿出时停止实验。固定、染色后行显微镜观察并拍照，细胞计数以 5个视野为准，提取结果计算均值来表现侵袭细胞数量。

1.3 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用 F/t检验，两两比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组患者血清检测中miR-21表达水平比较 观察组患者的miR-21相对表达量明显高于A组与B组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1；观察组中发生淋巴结转移的患者miR-21相对表达量明显高于无淋巴结转移患者，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1　 3组受试对象miR-21表达水平比较（±s）

表1　 3组受试对象miR-21表达水平比较（±s）

组别 　例数 　miR-21相对表达量A组 　65 　1.36±0.24 B组 　65 　0.81±0.16观察组 　65 　2.71±0.82 F值 　　4.97 P值 　　＜0.05

表2　 观察组中淋巴结转移与无淋巴结转移患者miR-21表达水平比较（±s）

表2　 观察组中淋巴结转移与无淋巴结转移患者miR-21表达水平比较（±s）

组别 　例数 　miR-21相对表达量无淋巴结转移 　26 　2.2±0.7淋巴结转移 　39 　3.6±1.1 t值 　　3.93 P值 　　＜0.05

2.2 乳腺癌细胞 miR-21表达水平比较 MCF-7、MDA-MB-231与MDA-MB-468乳腺癌细胞的miR-21相对表达量均明显高于HBL-100组，且MDA-MB-231与MDA-MB-468侵袭性乳腺癌细胞的miR-21相对表达量明显高于MCF-7非侵袭性乳腺癌细胞，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

表3　 乳腺癌细胞miR-21表达水平比较（±s）

表3　 乳腺癌细胞miR-21表达水平比较（±s）

注：与HBL-100组比较，△P＜0.05；与MCF-7比较，▲P＜0.05

组别 　　miR-21相对表达量HBL-100 　　0.97±0.08 MCF-7 　　1.96±0.16△MDA-MB-231 　　4.03±0.47△▲MDA-MB-468 　　3.82±0.89△▲

2.3 miR-21对MDA-MB-231侵袭性乳腺癌细胞侵袭与转移的影响 A组乳腺细胞迁移至小室细胞数量为（256±34），穿过基质胶细胞数量为（133±42），MDA-MB-231乳腺癌细胞迁移至小室细胞数量为（98±22），穿过基质胶细胞数量为（44±17）；转染miR-21抑制剂的MDA-MB-231侵袭性人乳腺癌细胞迁移至小室细胞数量与穿过基质胶细胞数量均明显低于A组乳腺细胞，组间比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，主要为乳腺腺上皮组织发生恶性病变，好发于40～60岁妇女，以围绝经期为高发阶段。乳腺肿瘤远处转移是导致患者病死的主要原因，而病灶转移为多基因参与的复杂过程，其发生机制尚未完全明确［4］。近年来，临床对于恶性肿瘤的病理生物学研究取得了较大进展，多项研究均证实miRNA与其发病、进展均具有密切关系［5］。miR-21在非实体瘤与实体瘤等疾病中往往都呈高表达状态，作为首个在恶性疾病患者血清中发现的 miRNA，受到了临床的高度重视［6］。既往研究认为，miR-21可促进靶向细胞相关基因凋亡，从而影响肿瘤细胞增殖与转移［7］。傅少梅等［8］的研究表明，针对患者开展miR-21检测可辅助三阴性乳腺癌的诊断；吴稚晖等［9］也指出，中晚期非小细胞肺癌患者的miR-21呈高表达，其表达水平与化疗效果成正相关；王卉等［10］研究则证实，乳腺癌患者血清与细胞中miR-21均为高表达状态，与其肿瘤细胞侵袭转移也具有一定关联。

本研究分别对乳腺癌、乳腺良性病变患者与正常女性的miR-21的表达水平进行了检测，结果显示乳腺癌患者的miRNA-21表达均显著高于其他两组，同时乳腺癌患者中发生淋巴细胞转移患者的miRNA-21水平更高。提示miR-21表达同乳腺癌发病与进展密切相关。为进一步证实两者之间的相关性，研究分别对正常乳腺细胞、非侵袭性乳腺癌细胞与侵袭性乳腺癌细胞的miR-21进行了测定，结果表明乳腺癌细胞的miRNA水平明显高于正常乳腺细胞，并且侵袭性乳腺癌细胞的miRNA水平更高。证实检测miR-21表达可为乳腺癌诊断与预后评估起到指导性作用。另外，本研究对侵袭性乳腺癌细胞应用miR-21抑制剂后，侵袭性乳腺癌细胞迁移至小室细胞数量与穿过基质胶细胞数量均明显低于正常乳腺组织，提示通过抑制miR-21表达能够控制乳腺癌进展。

综上所述，乳腺癌患者的miR-21呈高表达状态，其表达水平同癌细胞侵袭转移具有相关性，抑制miR-21水平有利于控制肿瘤细胞转移。

参考文献

［1］ 闵卫利，秦岭，马小斌，等.miR-145、miR-21、miR-10b在乳腺癌中的表达及意义［J］.国际外科学杂志，2014，41（6）：405-409.

［2］ 王恩远.miR-21表达异常与乳腺癌临床病理特征及预后的关系［J］.中国继续医学教育，2015，7（12）：23-24.

［3］ 曲莉莉，刘晓晴.循环微小RNA在肺癌中的研究进展［J］.国际肿瘤学杂志，2015，42（9）：693-695.

［4］ 骆广涛，王本忠.乳腺癌中EZH2与miRNA调控关系的研究进展［J］.安徽医学，2015，36（8）：1034-1036.

［5］ Farazi TA，Horlings HM，Ten Hoeve JJ，et al.MicroRNA sequence and expression analysis in breast tumors by deep sequencing［J］. Cancer Res，2011，71（13）：4443-4453.

［6］ Petrovie N，Mandusic V，Stanojevic B，et al.The difference in miR-21 expression levels between invasive and noninvasive breast cancers emphasizes its role in breast cancer invasion［J］.Med Oncol，2014，31（3）：867-867.

［7］ 黄婷，杨桂玲.MicroRNA-21在急性髓系白血病骨髓细胞中的异常表达及意义［J］.西安交通大学学报，2016，37（1）：98-102.

［8］ 傅少梅，殷初阳，宋晖.miR-21和miR-93联合检测在三阴性乳腺癌诊断中的价值［J］.现代中西医结合杂志，2014，23（26）：2868-2869.

［9］ 吴稚晖，李文灿，陈崇伟，等.Ⅲ期NSCLC患者血浆中miR-21表达及其临床意义［J］.海南医学，2015，26（6）：803-805.

［10］ 王卉，刘水逸，吴唐维，等.miR-21在乳腺癌中的表达及其对乳腺癌侵袭转移的影响［J］.中华检验医学杂志，2015，38（3）：186-190.

湖南中医药高等专科学校附属第一医院，湖南株洲 412000

【中图分类号】R737.9

【文献标志码】A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.07.048