免疫抑制剂治疗系统性红斑狼疮患者淋巴细胞亚群失调的疗效观察

黎志锋 陈国强 张红卫 林嘉鸿



免疫抑制剂治疗系统性红斑狼疮患者淋巴细胞亚群失调的疗效观察

黎志锋 陈国强 张红卫 林嘉鸿

【摘要】目的 探讨免疫抑制剂治疗系统性红斑狼疮（SLE）患者淋巴细胞亚群失调的疗效。方法 选取2014年1月至2015年7月佛山市第一人民医院收治的60例SLE患者为研究对象，其中未治疗和经免疫抑制剂治疗患者各30例，同时选取同期健康体检者60名作为对照组。采用流式细胞仪检测SLE组和对照组患者外周血T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞（NK）的比例，采用ELISA检测血清干扰素-γ（IFN-γ）及白细胞介素-4（IL-4）表达水平。结果 SLE组患者CD3+CD4+Th细胞比例、Th细胞/Ts细胞、CD3-CD16+CD56+NK细胞比例均明显低于对照组CD3+CD8+Ts细胞、CD3-CD19+B淋巴细胞比例均明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与对照组相比，SLE组患者血清IFN-γ水平、IFN-γ/IL-4比值均显著增高，而IL-4水平明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；使用免疫抑制剂治疗后，患者CD3+CD4+T淋巴细胞比例明显增加，CD3-CD19+B淋巴细胞比例明显降低，Th细胞/Ts细胞比值明显高于未治疗组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论 SLE患者经常用免疫抑制剂治疗后，Th细胞/Ts细胞比例得到有效调节和改变，B细胞数量下降，而且外周血淋巴细胞各亚群比例向正常方向调整，有效改善了患者淋巴细胞亚群失调状况。

【关键词】系统性红斑狼疮；淋巴细胞亚群；干扰素-γ；白细胞介素-4

系统性红斑狼疮（SLE）是一种免疫调节紊乱的自身免疫性疾病，常累及全身多系统和器官，患者的T淋巴细胞和B淋巴细胞异常活化、免疫功能障碍的同时产生大量自身抗体，导致组织和器官受损。目前，其发病机制尚未完全阐明，有研究显示，其与细胞因子表达紊乱和免疫复合物清除障碍有一定联系［1］。临床上糖皮质激素和免疫抑制剂仍是治疗SLE的一线药物，常用免疫抑制剂为环磷酰胺（CTX）和吗替麦考酚酯（MMF）。CTX主要通过阻断快速分裂的S期细胞从而抑制T和B淋巴细胞增殖，MMF发挥免疫抑制作用是通过选择性作用于激活的B淋巴细胞和 T淋巴细胞，然而免疫抑制剂改善患者病情是否通过影响各淋巴细胞亚群数量及比例目前尚未明确定论，有待进一步研究。本研究就免疫抑制剂对SLE患者淋巴细胞亚群失调的疗效进行探讨，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月至2015年7月我院收治的60例SLE患者为研究对象，其中未治疗和经免疫抑制剂治疗的患者各30例，治疗病例接受糖皮质激素联合CTX或MMF治疗时间不低于2个月，均符合SLE国际临床协作组（SLICC）2009年修订标准［2］。另外，选取同期健康体检者60名作为对照组。所有参与者均签署了知情同意书，本研究已经伦理学委员会审批通过。SLE组患者中，男11例，女49例，平均年龄（37.4±2.5）岁。SLE组经免疫抑制剂治疗组患者中，男5例，女25例，平均年龄（37.2±2.7）岁；未经免疫抑制剂治疗组患者中，男6例，女24例，平均年龄（37.5±2.3）岁。经免疫抑制剂治疗组与未经免疫抑制剂治疗组患者的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。对照组患者中，男12例，女48例，平均年龄（36.9±2.8）岁。SLE组与对照组患者的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 试剂与仪器 流式细胞仪检测的试剂及耗材均购自美国BD公司。荧光染料标记的直标抗体包括鼠抗人 CD45-多甲藻叶绿素蛋白/CD3-异硫氰酸荧光素/CD4-别藻青蛋白/CD8-藻红蛋白抗体和鼠抗人CD45-多甲藻叶绿素蛋白/CD3-异硫氰酸荧光素/CD16CD56-藻红蛋白/CD19-别藻青蛋白抗体，以及FACS溶血素等其他常用试剂。使用的检测仪器为BD 公司的 FACScalibur流式细胞仪。干扰素-γ （IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）的ELISA检测试剂盒购自Invitrogen公司。

1.3 方法 测定血清IFN-γ和IL-4：收集血液后，4 ℃下以3000 rpm离心10 min，离心半径为12.4 cm，分离得到血清，首先加入准备好的样品和标准品，37 ℃反应90 min后，采用磷酸缓冲盐（PBS）溶液或Tris缓冲盐溶液（TBS）洗板2次，加入生物素化人抗体工作液，37 ℃反应60 min后，然后用PBS或TBS洗板3次，加入亲和素-过氧化物酶复合物工作液，37 ℃反应30 min后，PBS或TBS洗板5次，加入TMB显色液，37 ℃反应，加入TMB终止液，30 min内用酶标仪在450 nm测定光密度（OD）值，最后计算出浓度。

外周血淋巴细胞亚群检测：使用 CD3/CD8/ CD45/CD4四色方案检测CD3+T细胞、CD8+T细胞和/CD4+T细胞；使用CD3/CD16+CD56/CD45/CD19四色方案检测CD3+T细胞、B细胞和NK细胞，具体操作方法：取两支试管分别标记为A和B，将10 μl两种抗体分别加入于A试管和B试管中，分别加入50 μl充分混匀的抗凝全血至试管底部，避免让血液污染管壁，轻轻摇匀，室温避光放置15 min，再加入500 μl的FACS溶血素，充分混匀，室温避光孵育 15 min，漩涡混匀样品后上机检测。上机检测后用MutiSET自动分析软件进行分析。

1.4 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，计数资料以百分率表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1　 SLE组与对照组患者淋巴细胞免疫表型比较（%，±s）

表1　 SLE组与对照组患者淋巴细胞免疫表型比较（%，±s）

组别 　例数 　CD3+CD4+Th细胞 　CD3+CD8+Ts细胞 　Th细胞/Ts细胞 　CD3-CD16+CD56+NK细胞 CD3-CD19+B细胞对照组 　60 　43±63 　29±6 　1.5±0.6 　7.2±4.8 　16±5 SLE组 　60 　30±8 　42±9 　0.8±0.3 　4.0±2.1 　21±6 t值 　　10.25 　9.49 　9.03 　4.77 　5.24 P值 　　0.00 　0.00 　0.00 　0.00 　0.00

2 结果

2.1 SLE组与对照组患者淋巴细胞免疫表型比较 SLE组患者CD3+CD4+Th细胞比例、Th细胞/Ts细胞、CD3-CD16+CD56+NK细胞比例均明显低于对照组CD3+CD8+Ts细胞、CD3-CD19+B细胞比例均明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

2.2 SLE组与对照组患者血清IFN-γ及IL-4水平比较 与对照组相比，SLE组患者血清IFN-γ水平、IFN-γ/IL-4比值均显著增高，而IL-4水平明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

2.3 常用免疫抑制剂对SLE患者外周血淋巴细胞亚群水平的影响 使用免疫抑制剂治疗后，患者CD3+CD4+T细胞比例明显增加，CD3-CD19+B细胞比例明显降低，Th细胞/Ts细胞比值明显高于未治疗组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

表2　 SLE组与对照组患者血清IFN-γ 及IL-4水平比较（±s）

表2　 SLE组与对照组患者血清IFN-γ 及IL-4水平比较（±s）

组别 　例数 　IFN-γ 　IL-4 　IFN-γ/IL-4对照组 　60 　14±3 　6.4±1.2 　2.3±1.2 SLE组 　60 　21±5 　3.6±0.6 　5.8±2.5 t值 　　8.52 　15.80 　9.79 P值 　　0.00 　0.00 　0.00

表3　 常用免疫抑制剂对SLE患者外周血淋巴细胞亚群水平的影响（%，±s）

表3　 常用免疫抑制剂对SLE患者外周血淋巴细胞亚群水平的影响（%，±s）

组别 　例数 CD3+T细胞CD3+CD4+Th细胞Th细胞/Ts细胞CD3-CD19+B细胞未治疗组 　30 　68±13 　36±11 　0.7±0.3　22±6治疗组 　30 　73±11 　43±13 　0.9±0.4　16±4 t值 　　1.48 　2.12 　2.73 　4.08 P值 　　0.14 　0.04 　0.01 　0.00

3 讨论

SLE在世界范围内均有出现，女性发病率明显高于男性，发病比例约为 10：1，主要发病群体为育龄期妇女，此外还包括少量老人及儿童［3］。目前，通过糖皮质激素和免疫抑制剂可控制免疫炎性反应，明显改善预后，提高生命质量。CD4+是辅助性T淋巴细胞表面的标志，而CD8+是抑制性T细胞和细胞毒性T细胞表面的标志，CD4+/CD8+是通过检测两种T细胞的数量来反映机体的免疫状态，尤其能表现细胞免疫状态［4］。本研究结果显示，与对照组相比，SLE患者由于 CD4+比例降低以及 CD8+比例增高，使CD4+/CD8+比值降低。有学者指出，SLE患者反抑制性T细胞（CD8+VV+）取代了绝大部分CD8+T细胞，使其不能显示抑制功能，进而阻断了其对CD4+T细胞的抑制作用；CD4+T细胞减少是因为CD4+T细胞亚群中的抑制诱导T细胞（CD4+2H4+）降低，不能诱导CD8+T细胞对B细胞产生抑制作用［5］。此外，其他学者研究还显示，SLE发病过程中B细胞的自噬可能受抑制［6，7］，B细胞存在耐受失衡现象，自身抗原反应性B细胞没有死亡却得以生存，从而使细胞比例升高，B细胞分化为浆细胞并分泌大量自身抗体，进而影响疾病的发生，研究显示，其与B细胞活化、B细胞寿命及B细胞凋亡相关的各种细胞因子处于异常水平相关［2］。

SLE存在T细胞分泌的细胞因子异常，主要是CD4+T细胞平衡失控和紊乱，细胞平衡改变导致产生的细胞因子也发生改变和偏移，进而导致免疫功能异常并造成病理损伤。本研究结果显示，SLE患者血清IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4比值较正常对照组明显增高，而血清IL-4水平较正常对照组明显降低。IFN-γ由Th1细胞分泌，介导细胞免疫反应，可以增强细胞毒性作用；IL-4是由Th2细胞分泌，可以促进抗体产生，参与变态反应性疾病及体液免疫性疾病的发生［8］。IFN-γ和IL-4作为Th1和Th2细胞的关键表达因子，它们表达异常反映了Th1和Th2细胞的紊乱，Th1细胞/Th2细胞数量和平衡改变参与多种疾病的发生及发展。然而，SLE患者外周血 Th1类及Th2类细胞因子表达情况尚未得到统一的结论，不同研究人员的结果存在一定差异。

使用环磷酰胺和吗替麦考酚酯等常用免疫抑制剂治疗后，患者CD3+CD4+T细胞明显增加，Th细胞/Ts细胞升高，CD3-CD19+B细胞明显降低，同以往研究结果［2-4］一致，猜测常用免疫抑制剂的作用机制是通过增加CD3+CD4+Th细胞，从而使SLE患者T细胞亚群趋向平衡及改善总体功能状态，同时也可以降低患者B细胞水平，缓解由过量B细胞产生的自身抗体带来的免疫损伤和不良反应。

综上所述，SLE患者经常用免疫抑制剂治疗后，Th细胞/Ts细胞比例得到有效调节和改变，B细胞数量下降，而且外周血淋巴细胞各亚群比例向正常方向调整，有效改善了患者淋巴细胞亚群失调的病况。

参考文献

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［3］ 苏利沙，张根豪，邓少丽，等.常用免疫抑制剂治疗对系统性红斑狼疮患者淋巴细胞亚群的影响［J］.郑州大学学报（医学版），2014，49（2）：236-239.

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佛山市第一人民医院，广东佛山 528000

【中图分类号】R593.24+1

【文献标志码】A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.07.014

作者简介：黎志锋（1978.9-），硕士学位，主治医师。研究方向：风湿免疫疾病学

The Effect of Immunosuppressive Agents on Lymphocyte Subsets in Patients with Systemic Lupus Erythematosus

Li Zhifeng Chen Guoqiang Zhang Hongwei Lin Jiahong

【Abstract】Objective to investigate the effect of immunosuppressive agents on the lymphocyte subsets imbalance in patients with systemic lupus erythematosus （SLE）.Methods That the July January 2014 to 2015，Foshan City the first people's Hospital of 60 cases of SLE patient chooses as the research object，which was not in treatment and the immune inhibitors in the treatment of patients with 30 cases in each.At the same time，the selection of healthy in the same period，60 patients as control group.The SLE cells，B cells and natural killer （NK） cells in peripheral blood were detected by flow cytometry.The expression levels of interferon gamma （IFN-γ） and interleukin 4 （IL-4） in serum were detected by ELISA.Results SLE patients CD3+CD4+Th cell ratio，Th cell /Ts cells，CD3-CD16+CD56+NK cell proportion of were significantly lower than those of the control group CD3+CD8+Ts cells，CD3-CD19+B cell ratio was significantly higher than that of the control group，differences were statistically significant（P＜0.05）；compared with the control group，the SLE patients who serum IFN gamma levels，ratio of IFN-γ/IL-4 were significantly increased，and the level of IL-4 decreased significantly，the differences were statistically significant（P＜0.05）；the use of immunosuppressive therapy，a marked increase in the proportion of patients with CD3+CD4+T cells，CD3-CD19+B cell ratio was significantly decreased，Th cells /Ts cell ratio significantly higher than untreated group，differences were statistically significant（P＜0.05）. Conclusion SLE patients are often treated with immunosuppressive agents，effectively regulate and change th cell /Ts cell proportion and the decline in the number of B cells，and peripheral blood lymphocyte subsets in proportion to the normal direction adjustment，effectively improve the lymphocyte subsets in patients with disorders of.

【Key words】Systemic lupus erythematosus；Lymphocyte subsets；IFN-γ；IL-4