喹啉类锌配合物的合成、结构及化学核酸酶活性的研究

张永坡，吕佳苑，杨佳佳，白雪，王玉峰，高烨，赵晋忠

(山西农业大学 文理学院，山西 太谷 030801)



喹啉类锌配合物的合成、结构及化学核酸酶活性的研究

张永坡，吕佳苑，杨佳佳，白雪，王玉峰，高烨，赵晋忠*

(山西农业大学 文理学院，山西 太谷 030801)

摘要：[目的]探索配合物对DNA的断裂作用，寻找新型高效的核酸断裂试剂。[方法]设计合成了一例未见文献报道的基于喹啉骨架的二羧酸单核锌(II)配合物[ZnL(H2O)3]·H2O。运用元素分析、红外吸收光谱方法表征了该配合物，并利用X-射线单晶衍射仪解析其单晶结构，利用琼脂糖凝胶电泳手段研究了其化学核酸酶活性。[结果]解析结构表明配合物中Zn(II)中心为七配位的畸变五角双锥结构；配合物表现出一定程度的切割DNA活性。[结论]本研究为设计合成新型高效、结构简单的化学核酸酶提供有价值的研究基础。

关键词：喹啉类配体；锌配合物；晶体结构；DNA切割

天然核酸酶无论从品种、数量、价格还是对碱基对的特异性识别方面均不能满足现今急速增长的需要，因此人工合成各种新颖的化学核酸酶成为科研工作者们的重要任务[1～3]。另一方面，许多天然核酸酶在表达其活性时需要金属离子的激活，这使得金属配合物作为人工化学核酸酶的研究自上世纪八十年代以来逐渐发展成为生物无机化学的一个热门研究领域[4～9]。1979年Sigman等[10]报道了第一个双1，10-邻菲啰啉铜化学核酸酶，科研工作者们对金属配合物的核酸酶活性的研究兴趣随之迅速上升。特别是近十几年来，人们对其理论价值和实际应用进行了广泛、深入的研究和拓展，开发出了一系列可用于DNA结构探针、DNA断裂试剂、分子光诱导开关、细胞示踪试剂以及抗肿瘤药物等领域的化学核酸酶[8,9]。

喹啉类衍生物作为一类具有广泛生物活性的含氮杂环化合物，具有良好的生物活性，在其结构中引入不同取代基将会改变或增强其活性[11,12]。此外喹啉还可以与金属离子形成稳定的配合物，在金属药物的合成与研发中占有重要的地位。锌(Zn)是生命体中不可缺少的元素，广泛存在于300多种酶中[13]。Zn2+具有低毒性、氧化还原惰性及较高的生物利用度等特点。因此人们将Zn(II)配合物作为重点研究的人工化学核酸酶试剂和潜在的治疗性药物[14～17]。

为了进一步探索配合物对DNA的断裂作用，寻找新型高效的核酸断裂试剂。本文设计了一种全新的喹啉二羧酸衍生物配体(见图1)，合成了一例未见文献报道的单核锌配合物，解析了其晶体结构，利用琼脂糖凝胶电泳手段检测配合物的化学核酸酶活性，结果表明该化合物表现出一定程度的切割DNA的活性。本项研究为设计合成新型高效、结构简单的化学核酸酶以及为深入探讨小分子金属配合物作为核酸断裂试剂及潜在治疗性药物的作用机理提供了有价值的研究基础。

图1　配体L的合成路线图Fig.1　Synthesis of L (sodium 8-(carboxylatomethoxy)quinoline-2-carboxylate)

1实验部分

1.1试剂和仪器

所用化学试剂和药品均为市售分析纯产品。化学核酸酶活性测试所用的Tris、EDTA、NaCl、H3BO3等均为优级纯试剂。pBR322DNA(BR) 购自Fermentas公司；溴化乙锭(EB)(AR)，琼脂糖为Sigma-Aldrich公司产品。

红外吸收光谱、元素分析(C，H，N)、单晶衍射分析分别用PerkinElmerFT-IRSpecturmTwo型傅立叶变换红外光谱仪、Perkin-Elmer240型元素分析仪、BrukerSmart1000衍射仪测定。

所涉及凝胶电泳实验及成像实验分别用恒压DYY-III型电泳仪及UVItec自动凝胶成像分析系统进行。

1.2化合物的合成

1.2.1配体L的合成

配体L的合成参照文献[18]描述的方法进行改进。称取2.4g2-甲基-8-羟基喹啉(15mmol)，2.5g溴乙酸乙酯(15mmol)依次溶于30mL丙酮中并不断搅拌，缓慢加入8gK2CO3粉末(58mmol)，回流24h。冷却至室温后过滤，旋转蒸发得油状粗产品。干燥后将其溶于25mL二氧六环中并不断搅拌，缓慢加入1.8gSeO2(16mmol)，回流12h。冷却，旋转蒸发除去溶剂，往体系中加入50mL0.5mol·L-1稀HCl，用乙酸乙酯萃取，有机层合并后经旋转蒸发得油状粗产品。将其溶入25mL乙醇中并不断搅拌，缓慢加入10mLNaOH溶液(4.5mol·L-1)，回流2h，往体系中加入25mL乙醇后冷却，有深黄色沉淀析出，用95%乙醇重结晶，产率为47%。元素分析/%，理论值(C12H7NNa2O5):C, 49.50;H, 2.42;N, 4.81. 实验值:C, 49.41;H, 2.67;N, 4.79.FT-IR(KBr, ν,cm-1): 3 348, 1 615, 1 507, 1 480, 1 421, 1 385, 1 315, 1 265, 1 107, 824.

1.2.2配合物[ZnL(H2O)3]·H2O的合成

准确称取0.2mmol的配体L，用10mL无水甲醇溶解，经恒压滴液漏斗缓慢滴加10mL的ZnCl2(27mg, 0.2mmol)的水溶液，混合物在室温下搅拌3h后过滤，滤液于室温静置，缓慢挥发溶剂10d后，适合于X-射线衍射测试的黄色棱状晶体析出，将晶体过滤并用少量冷的乙醚淋洗，干燥后称重，产率为40%。元素分析/%，理论值(C12H15NO9Zn)：C, 37.67;H, 3.95;N, 3.66. 实验值：C, 37.59;H, 4.02;N, 3.62.FT-IR(KBr, ν,cm-1): 3 355, 1 620, 1 508, 1 470, 1 421, 1 398, 1 381, 1 316, 1 267, 1 110, 821。

1.3配合物的晶体结构测定

挑选适合于X-射线单晶衍射的晶体(0.40mm×0.25mm×0.10mm)，在室温下(293K)，使用经石墨单色化的MoKα辐射作为入射光源(λ= 0.071 073nm)，以ω-2θ连续扫描方式收集所有独立的衍射点。在解析过程中，衍射强度数据用SADABS程序校正。用各向异性热参数法对所有非氢原子进行全矩阵最小二乘法修正，氢原子则由几何理论加氢程序自动添加。全部计算利用SHELXTL程序包完成。相关晶体学数据分别列于表1和表2中。

表1　配合物的晶体学参数

1.4化学核酸酶活性实验方法

1.4.1缓冲溶液的配制

缓冲液均用三次蒸馏水配制，配制方法参照文献[19]中描述方法。电泳实验在缓冲溶液1(含50mmol·L-1Tris和18mmol·L-1NaCl，pH=7.2)和TBE电极缓冲液(含44mmol·L-1Tris，44mmol·L-1H3BO3和1mmol·L-1EDTA，pH= 8.3)中进行。

1.4.2琼脂糖凝胶电泳实验

用三次蒸馏水配制0.9%的琼脂糖凝胶，其中EB的浓度为0.5mg·L-1。在终止剂中加入少量溴酚蓝以指示电泳的进程。基本实验步骤：在2mL样品管中依次加入一定量的pBR322DNA(浓度为0.1g·L-1)，一定浓度的配合物溶液及一定体积的缓冲溶液1，轻微震荡混匀。将样品管置于恒温水浴中(37 ℃)恒温3h后，加入2μL反应终止液，再次混匀，使反应液的最终体积保持为20μL。将样品加到琼脂糖凝胶槽中，120V恒压条件下在TBE电泳缓冲液中进行电泳，最后经UVItec自动凝胶成像分析系统记录并处理数据。

2结果与分析

2.1配合物的晶体结构

晶体结构解析结果表明：该配合物属于三斜晶系，P-1空间群(见图2)，其基本结构单元由一个[ZnL(H2O)3]和外界的一个H2O构成。配合物中Zn(II)中心为七配位模式，配位原子由一个喹啉N原子、一个酚醚O原子、两个羧酸根O原子及三个水分子O原子构成，其几何构型可描述为畸变的五角双锥结构。相关晶体学参数列于表1中，配合物的主要键长和键角数据列于表2中。

图2　配合物[ZnL(H2O)3]·H2O的晶体结构图Fig.2　Crystal structure of the complex

在锌配位中心中，五个原子N1、O1、O2、O6、O7占据平面位置，从表2中可知围绕锌中心的处于五角平面的五个键角(63.40(13)～81.36(16)°)之和为360.04°；而O4和O5原子则占据轴位置，O(5)-Zn(1)-O(4)键角为173.33(15)°。此外，Zn(1)-O(1) 键长(0.2557(4)nm)要远远大于其它六个配位键长(0.2062(3)～0.2277(4)nm)(见表2)，表明Zn(1)-O(1)为弱配位键。

2.2琼脂糖凝胶电泳检测配合物对质粒DNA的断裂反应

在近生理条件下(Tris-HCl/NaCl缓冲液，pH=7.2，37 ℃)，恒温3h，通过改变配合物浓度，检测质粒DNA的断裂程度。图3所示为不加任何诱导剂，配合物切割pBR322DNA(0.1mg·L-1)的凝胶电泳图。泳道0：质粒DNA空白对照；泳道1～5：DNA+配合物(50, 200, 350, 500, 650μmol·L-1)。泳道0为DNA空白，FormIDNA(闭环超螺旋型DNA)的含量约为98%，说明质粒DNA的纯度较高，实验数据可用。泳道1～5配合物在实验浓度50～650μmol·L-1范围内没有明显的FormIIDNA(开环缺刻型DNA)出现，表明浓度为650μmol·L-1的配合物未表现出切割DNA的能力，即质粒DNA未发生断裂开环。

表2　配合物的部分键长/nm和键角/°数据

图3　不加诱导剂,不同浓度配合物切割pBR322 DNA的凝胶电泳图Fig.3　In the absence of inducer, gel electrophoresis diagram showing the cleavage of pBR322 DNA at different complex concentrations

图4所示为在同等实验条件下，恒温3h，加入诱导剂过氧化氢(H2O2)后，不同浓度的配合物切割pBR322DNA(0.1g·L-1)的凝胶电泳图。泳道0：DNA空白对照；泳道1：DNA+0.25mmol·L-1H2O2；泳道2～5：DNA+H2O2+配合物(5, 20, 35, 50μmol·L-1)。泳道1没有明显的FormIIDNA出现，说明H2O2本身对DNA不发生切割作用，可作为空白对照，实验数据可用。可以看出加入诱导剂过氧化氢后，随着配合物浓度的增大，其切割DNA的能力有较大的提高。配合物的浓度在35μmol·L-1时有约46%的FormII(开环缺刻型DNA)产生，说明配合物具有断裂DNA的能力；当浓度增大至50μmol·L-1时，有近50%的FormII产生。结果表明过氧化氢作为诱导剂发挥着重要的作用，使得配合物的切割DNA能力有很大的提高。

图4　加入诱导剂后，不同浓度配合物切割pBR322 DNA的凝胶电泳图Fig.4　In the presence of inducer (H2O2), gel electrophoresis diagram showing the cleavage of pBR322 DNA at different complex concentrations

3讨论与结论

3.1讨论

近几十年来，化学核酸酶在模拟天然核酸酶、DNA断裂试剂等方面的研究已成为化学和生物学中最为活跃的前沿领域之一。DNA是重要的生命遗传物质，被认为是药物作用的主要生物靶点。探讨DNA与小分子间的相互作用，以及与药物作用机理之间的联系，对于药物设计与合成以及新药的开发与研究，都有重要的意义。

DNA切割即通过化学反应将长链的DNA分子断裂成较短的片段。本文设计合成了一例新型的以喹啉衍生物为配体的单核锌配合物[ZnL(H2O)3]·H2O，在过氧化氢的诱导活化下，较低浓度(35μmol·L-1)的配合物就可以表现出良好的切割DNA的能力。这归因于喹啉类衍生物作为一类具有广泛生物活性及药理活性的含氮杂环化合物，具有大的平面芳环结构。在喹啉结构中引入含N、O配位原子的官能团与金属形成稳定的配合物，使其能与DNA相互作用。此外，低毒的配位中心金属Zn(II)自身较高的生物利用度也使得该配合物与DNA的作用能力增强。

目前，配合物作为人工核酸酶在DNA的定点切割方面研究还具有较大的挑战，因此，进一步探索新配合物对DNA的断裂和识别机理，寻找新型高效的核酸定点断裂试剂则会是我们未来的研究工作重点之一。

3.2结论

本文设计合成了一例未见文献报道的喹啉衍生物配体、相应单核锌配合物[ZnL(H2O)3]·H2O，运用元素分析、红外吸收光谱方法对其进行表征，并利用X-射线单晶衍射仪解析了配合物的单晶结构，结构表明Zn(II)中心为七配位的畸变五角双锥结构，其中Zn(1)-O(1)为弱配位键。利用琼脂糖凝胶电泳手段检测了其化学核酸酶活性，结果显示配合物在过氧化氢诱导剂作用下表现出了一定程度的切割DNA活性。研究结果对进一步研究喹啉及其衍生物过渡金属配合物与DNA的相互作用，发现高效化学核酸酶断裂试剂和研发金属类治疗性药物，具有一定的理论和实践意义。

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(编辑：武英耀)

收稿日期：2016-03-31 修回日期：2016-05-23

作者简介：张永坡(1983-)，男(汉)，河北石家庄人，讲师，博士，研究方向：有机合成及生物无机化学 *通讯作者：赵晋忠，教授，硕士生导师。Tel：0354-6287122；E-mail：zhaojinzhongnd@163.com

基金项目：山西农业大学引进人才科研启动金(2013YJ41)；山西农业大学科技创新基金(2014005)；山西农业大学大学生科技创新项目(13-017，2015085)

中图分类号：O614.24+1

文献标识码：A

文章编号：1671-8151(2016)08-0599-05

Synthesis,structure,DNAcleavageactivityofzinc(II)complexeswithquinolinederivativedligand

ZhangYongpo,LvJiayuan,YangJiajia,BaiXue,WangYufeng,GaoYe,ZhaoJinzhong*

(College of Arts and Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China)

Abstract:[Objective]In order to further explore the DNA cleavage of new and efficient nucleic acid fracture reagent. [Methods]a new mononuclear Zinc(II) complex [ZnL(H2O)3]·H2O of quinoline derivatived ligand (L=sodium 8-(carboxylatomethoxy)quinoline-2-carboxylate has been synthesized). The conpler was characterized using element analyses and infrared spectroscopy. The structure of the complex has been determined by X-ray diffraction crystallographic method. [Results]The Zn(II) center was heptacoordinated with O6N donor sets and the geometry around metal center can be best described as distorted pentagonal bipyramidal. The nuclease activity of the complex has been investigated by gel electrophoresis, and the result showed that complex exhibited a certain chemical nuclease activity. [Conclusion] This study would be beneficial to design efficient and simple structural chemical nuclease.

Key words:Quinoline derivatived ligand; Zinc(II) complex; Crystal structure; DNA cleavage