恩施地枇杷水提取物及其萃取成分的抑菌活性研究

2016-08-02杜银香

湖北民族大学学报(医学版) 2016年2期

关键词：正丁醇恩施枇杷

杜银香

1.武汉大学基础医学院(湖北武汉 430071)2.湖北民族学院医学院(湖北恩施 445000)

恩施地枇杷水提取物及其萃取成分的抑菌活性研究

杜银香1,2

1.武汉大学基础医学院(湖北武汉 430071)2.湖北民族学院医学院(湖北恩施 445000)

目的对恩施民间药用植物地枇杷的水提取物及其萃取成分的抑菌活性进行研究，为其进一步开发利用提供依据。方法采用水煎煮法得到地枇杷水提取物，并依次用乙酸乙酯，正丁醇对水提取物进行萃取，得到不同样品，以金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌、铜绿假单胞菌作为待测菌,采用牛津杯法和琼脂稀释法测定各样品对待测细菌的影响。结果①水提取物及其萃取成分对大肠埃希菌无抑菌活性。②水提取物的抑菌圈直径为8.7～14.6mm，乙酸乙酯萃取部分的抑菌圈直径为8.7～12.7mm，正丁醇萃取部分的抑菌圈直径为8.6～9.4mm，水层部分的抑菌圈直径为8.8～11.3mm。③水提取物的最低抑菌浓度为25～50g/L，乙酸乙酯萃取部分的最低抑菌浓度为0.5～1.0g/L，正丁醇萃取部分的最低抑菌浓度为1.0g/L，水层部分的最低抑菌浓度为2.5～5.0g/L。综合比较抑菌效果：乙酸乙酯萃取部分>正丁醇萃取部分>水层部分>水提取物。结论地枇杷水提取物及其萃取成分有一定的广谱抑菌活性，具有一定的药用开发价值。

地枇杷；水提取物；萃取成分；抑菌活性

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheantibacterialactivityofextractanditsextractionsfromFicusTikouaBurwaterinEnshiandprovidescientificbasisforfurtherdevelopmentanduse.MethodsTheFicusTikouaBurwaterwasextractedbythewaterdecocting,andthewaterwasextractedbyethylacetateandn-butylalcoholintodifferentsamples.TheStaphylococcusaureus,epidermalStaphylococcusaureus,Escherichiacoli,Enterobacteraerogenes,ProteusandPseudomonasaeruginosabacteriawereregardedasthebacteriatobetested.TheimpactofthesamplesonthesixkindsofbacteriawastestedbymethodsofOxfordcupandagardilution.Result①TheextractionsofFicusTikouaBurhadnoantibacterialactivitytoE.coli.②Thediameterofinhibitionzoneoftotalextract,ethylacetateextract,n-butylalcoholextractandwaterextractwere8.7～14.6,8.7～12.7,8.6～9.4,8.8～11.3mm.③TheMICoftotalextract,ethylacetateextract,n-butylalcoholextractandwaterextractwere25～50,0.5～1.0,1.0,2.5～5.0g/L.Aftercomparisonofantibacterialeffect:ethylacetateextract>n-butylalcoholextract>waterextract>totalextract.ConclusionTheextractionsofFicusTikouaBurhadantibacterialactivity,soithadmedicaldevelopmentvalues.

【Keywords】FicusTikouaBur;waterextract;extractions;antibacterialactivity

地枇杷(Ficus tikoua Bur.)为桑科榕属植物，又名地瓜藤，地石榴，地胆紫，地果，过山龙等，主要分布在陕西南部、湖北、湖南、云南等地，生长在海拔500～2 650m的山坡、草坡或岩石缝中[1]，是土家族、苗族、傣族等少数民族常用的民族药。全株可入药,味苦、性寒，清热利湿，活血通络，解毒消肿，主治肺热咳嗽，痢疾，小儿消化不良，风湿疼痛，带下，跌倒损伤[2]。国内外对该属植物的研究表明，该属植物有降血糖、松弛平滑肌、抗肿瘤、抗菌等作用[3]。目前对地枇杷的研究主要集中在对其化学成分的分离及鉴定[4]，鲜有其体外抑菌作用方面的报道。恩施本地野生地枇杷资源丰富，为了解本地野生地枇杷的抑菌作用，本文对地枇杷水提取物及其萃取成分进行了体外抑菌试验，以期为地枇杷中抑菌活性成分的进一步筛选和药用开发提供理论依据。

1　材料与方法

1.1主要仪器及试剂CL-32L型自动高压蒸汽灭菌器(日本ALP公司),XMT-9017型电热恒温恒湿培养箱(重庆永恒试验仪器厂)，SSW型微电脑电热恒温水槽(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。MH琼脂(杭州微生物试剂有限公司，批号20150309)，营养琼脂(杭州微生物试剂有限公司，批号20150308)，庆大霉素(4万IU/mL,济南利民制药有限责任公司，批号14120403)，二甲基亚砜(分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号T20100908)。地枇杷于2015年10月采自湖北民族学院校园内，经湖北民族学院中医药学院胡泽华博士鉴定为桑科榕属植物地枇杷(Ficus tikoua Bur.)。大肠埃希菌CMCC44102，产气肠杆菌CMCC45103，金黄色葡萄球菌CMCC26003，表皮葡萄球菌CMCC12228,普通变形杆菌CMCC49027均为湖北民族学院医学院微生物实验室保存菌种,铜绿假单胞菌为临床分离菌株，由湖北民族学院附属医院检验科提供。

1.2地枇杷不同提取物的制备

1.2.1水提取物的制备称取地枇杷200g，加10倍水浸泡30min后，加热至沸腾，文火保持1h，用6层纱布过滤；药渣加5倍水，加热至沸腾后，文火保持30min，6层纱布过滤，合并2次的滤液，经100℃恒温水浴浓缩至200mL,药液浓度为1 000g/L。经6 000r/min离心15min，取上清液，即得水提取物。

1.2.2萃取成分的制备将制备的水提取物原液依次用乙酸乙酯，水饱和正丁醇萃取，分别得到不同萃取成分和水层部分，取乙酸乙酯、正丁醇萃取成分适量，先用适量二甲基亚砜(DMSO)溶解后，配置成浓度为20g/L的溶液(含DMSO为1%)，水层部分配置成100g/L的溶液。各药液用孔径0.2μm无菌薄膜滤菌器过滤后备用。

1.3阳性和阴性对照溶液的制备将庆大霉素注射液稀释成100IU/mL，作为阳性对照溶液，水提取物及萃取后水层部分阴性对照为无菌蒸馏水，乙酸乙酯、正丁醇萃取成分阴性对照为1%DMSO水溶液。各药液用孔径0.2μm无菌薄膜滤菌器过滤后备用。

1.4菌种准备将各种待测菌接种到营养琼脂平板上，挑取培养了18h的各种纯菌，直接用生理盐水稀释比浊到0.5号麦氏标准浓度，再1∶10稀释成107cfu/mL，15min内，将上述被检菌株悬液接种到MH琼脂平板上。

1.5体外抑菌活性的测定

1.5.1牛津杯法[5]测定抑菌活性首先在直径90mmMH琼脂平板上加入0.1mL菌液后用无菌L型玻棒涂布，其次在涂菌后的平板上均匀放置7个牛津杯，每个小杯中加入药液100μL(其中4个小杯中分别加入待试样品，2个小杯中分别加入无菌水和DMSO溶液作阴性对照，1个小杯中加入阳性对照。)，最后放入37℃恒温恒湿培养箱中培养18～24h后观察结果。每个药液重复3次。用十字交叉法测量其抑菌圈直径。

1.5.2琼脂稀释法[6]MIC根据牛津杯法的结果，选择抑菌效果明显的细菌，测量其最低抑菌浓度(MIC)。首先将待测药液进行一系列倍比稀释后,分别取2mL加入直径90mm的空培养皿内，再取灭菌后已在55℃水浴中平衡0.5h以上的MH琼脂18mL加进培养皿内(药物∶MH琼脂=1∶9)，边加边摇晃平板，使药液和培养基充分混匀，最后用微量加样器取1μL菌液接种到平板的划定区域，使接种后所形成的菌液圈直径约5～8mm，待接种点菌液干后移动平板，放入37℃恒温恒湿培养箱中培养16～20h后观察结果。

2　结果

2.1地枇杷水提取物及其萃取成分的抑菌作用地枇杷水提物及其萃取成分对大肠埃希菌无抑菌作用，对其他常见细菌均表现出一定的抑菌活性。除正丁醇萃取部分外，其他各部分都是对金黄色葡萄球菌的作用最强，见表1。

表1　地枇杷水提取物及其萃取成分的抑菌作用±s)

2.2地枇杷水提物及其萃取成分对不同细菌的最低抑菌浓度地枇杷水提取物对待测细菌的MIC范围为25～50g/L。乙酸乙酯萃取部分对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌的MIC最低，仅为0.5g/L。正丁醇及水层部分对待测细菌的MIC范围为1.0～5.0g/L，见表2。

表2　地枇杷水提取物及其萃取成分

3　讨论

恩施素有“华中药库”的美誉，药用植物资源丰富，当地少数民族具有悠久而丰富的医药文化[7]。地枇杷作为一种当地少数民族常用的中草药，在恩施民间一般都是服用其水煎剂来治疗疾病，因此本试验采用了水煎煮法来提取其中的抑菌活性物质。通过研究发现，地枇杷水提取物及其萃取成分对试验所选择的6种细菌的抑菌作用差异较大，其中对金黄色葡萄球菌作用最强，对大肠埃希菌无抑菌作用。同时还发现，乙酸乙酯和正丁醇萃取部分对常见的5种细菌的MIC低于水层部分和水提取物，提示其抑菌活性物质可能主要是一些弱极性或中等极性的物质，推测可能是黄酮类、生物碱类成分，下一步将进行地枇杷主要抑菌活性物质的分离纯化与结构分析研究，从而进一步明确其抑菌作用机理。

目前,由于人类对抗生素的广泛使用,特别是不合理使用,导致耐药性菌株逐渐增多,很多原来有效的抗生素都发现了相应的耐药菌株[8]。金黄色葡萄球菌是常见的致病菌，其耐药菌株也在逐年增加，对青霉素G的耐药菌株已达90%以上[9]，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，已经成为医院感染最常见的致病菌。铜绿假单胞菌也具有多重耐药的特性，能天然抵抗多种抗菌药物。通过研究发现，地枇杷提取物对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌在体外都具有较好的抑菌活性。虽然体外试验的环境和体内不一样，但这也为临床上治疗这些耐药菌株的感染提供了一些新的思路。

中草药是中国的传统资源，它有西药不具备的优势,是从整体水平发挥抗感染作用，具有副作用少,不易出现耐药性等特点[10]。在许多中草药中，已经发现的具有较强抑菌活性化合物的结构与现有抗生素的化学结构是不相似的，这也为下一步寻找开发新药带来了很大的空间。本研究表明,地枇杷具有切实有效的抑菌活性,对于进一步开发利用地枇杷资源具有一定的指导意义。

[1]张秀实,吴征镒.中国植物志:被子植物门.双子叶植物纲.桑科[M].23卷，第1分册.北京:科学出版社,1997:156-157.

[2]吴家荣,邱德文.中国常用中草药彩色图谱[M].贵阳:贵阳科技出版社，1993:170.

[3]范明松,叶冠,黄成钢.榕属植物化学成分和药理作用研究进展[J].天然产物研究与开发,2005,17(4):497-504.

[4]郭良君,谭兴起,郑巍，等.地瓜藤化学成分研究[J].中草药,2011,42(9):1 709-1 711.

[5]唐由凯,刘作春,袁杰.医学微生物学试验教程[M].北京:中国科学技术出版社,2007:85-86.

[6]倪语星,尚红.临床微生物学与检验,第四版[M].北京:人民卫生出版社,2007:61.

[7]杨瑾,李国贵,朱耀乾.土家族医药文化视角下中药化学教学的实践与思考[J].湖北民族学院学报(医学版),2012,29(2):72-73.

[8]闫绍悦，林树乾，傅剑，等.五味子提取液抑菌活性研究[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(10):142-146.

[9]何颖,董珊,张春.马甲子叶抑菌有效部位的筛选[J].中国实验方剂学杂志,2015,21(7):159-162.

[10]李娟,麻晓雪,李顺祥，等.湖南产石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取组分抑菌活性的比较研究[J].中成药,2014,36(2):393-395.

责任编辑：牟冬生

StudyonAntibacterialActivityofExtractanditsExtractionsfromFicusTikouaBurWaterinEnshi