艾灸对脊髓横断术后大鼠胃黏膜组织相关因子及热休克蛋白70表达的影响

陈英 于隽 杨舟 李飞 陈果 向丽婷 向娟 彭亮

摘要：目的 观察艾灸对大鼠胃黏膜组织白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、表皮生长因子（EGF）及热休克蛋白70（HSP70）表达的影响，探讨艾灸对胃黏膜的保护效应与脊髓的关系。方法 实验大鼠采用无水乙醇+阿司匹林灌胃制作胃黏膜损伤模型。将48只SD大鼠随机分为正常组、模型组、艾灸模型组和艾灸+脊髓横断组，每组12只。艾灸+脊髓横断组大鼠行脊髓横断手术，并予以艾灸干预。GUTH法计算胃黏膜组织损伤指数（UI），ELISA检测血清IL-1β、TNF-α和EGF含量；Western blot检测胃黏膜组织HSP70蛋白表达。结果 与模型组比较，艾灸模型组大鼠胃黏膜组织UI下降、EGF含量升高，血清IL-1β、TNF-α含量降低（P<0.05，P<0.01）；与艾灸模型组比较，艾灸+脊髓横断组大鼠胃黏膜组织UI升高、EGF含量降低，血清IL-1β、TNF-α含量升高（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，艾灸模型组和艾灸+脊髓横断组大鼠胃黏膜组织HSP70蛋白表达均明显增加（P<0.01）。结论 脊髓是艾灸对胃黏膜损伤修复与保护因子表达的重要调节途径。

关键词：脊髓横断术；艾灸；胃黏膜损伤；保护因子；热休克蛋白70；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.021

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）08-0080-03

艾灸是一种温热刺激原，具有保护机体胃黏膜的功效。前期研究表明，艾灸对于引起胃黏膜损伤的多种复杂因素有调节性[1-2]。本研究在脊髓横断的前提条件下，观察艾灸对大鼠胃黏膜组织白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、表皮生长因子（EGF）及热休克蛋白70（HSP70）表达的影响，探讨艾灸对胃黏膜的保护效应与脊髓的关系。

1 实验材料

1.1 动物

48只健康成年SD大鼠，鼠龄3～4月，体质量180～200 g，雌雄各半，许可证号SYXK（湘）2013-0005。饲养于湖南中医药大学动物中心实验室，温度23～26 ℃，湿度40%～60%，自由饮食饮水。

1.2 艾条和药物

温灸纯艾条，蕲春时珍本草科技有限公司，规格φ4 mm×100 mm。青霉素，华北制药股份有限公司，批号20141001；阿司匹林泡腾片，阿斯利康制药有限公司，批号20141202。

1.3 主要试剂与仪器

10%甲醛（国药集团化学试剂有限公司），ELISA检测试剂盒、HSP70免疫组化检测试剂盒（长沙维尔公司）。自制艾灸支架，隔热薄膜。

2 实验方法

2.1 分组、造模及干预

实验大鼠随机分为正常组、模型组、艾灸模型组和艾灸+脊髓横断组，每组12只，雌雄分笼饲养7 d。采用无水乙醇和阿司匹林灌胃制作胃黏膜损伤模型，艾灸+脊髓横断组大鼠予以脊髓横断手术，其他组正常饲养。术后大鼠用绳子俯卧位捆绑在鼠板上，参照文献[3]腧穴定位“足三里”，剪毛，后贴上有孔隔热贴，再把艾条固定在专门制作的艾灸支架上，将点燃的艾条施灸大鼠双侧“足三里”，距离穴位约0.5 cm。每日2次（8：00，14：00），连续8 d。正常组和模型组大鼠予8 d假艾灸捆绑操作。

2.2 胃黏膜组织损伤指数测定

大鼠腹腔注射20%乌拉坦（0.6 mL/100 g）麻醉，将幽门及贲门部结扎处理，摘取全胃，冰0.9%氯化钠溶液冲洗，GUTH法计算大鼠胃黏膜损伤指数（UI）。损伤≤1 mm（包括斑点糜烂）计1分；1 mm<损伤≤2 mm计2分；2 mm<损伤≤3 mm计3分；3 mm<损伤≤4 mm计4分；损伤≥4 mm计5分；损伤宽度>2 mm者计分加倍。

2.3 胃黏膜组织相关因子测定

ELISA检测大鼠血清IL-1β、TNF-α和胃黏膜组织EGF含量，严格按照试剂盒说明进行操作；Western blot检测大鼠胃黏膜组织HSP70蛋白表达，应用Imag J对WB条带进行灰度分析，以β-actin作为内参对照，将目的蛋白灰度值除以β-actin灰度值校正误差，以相对灰度值表示。

3 统计学方法

采用SPSS23.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示。符合正态分布采用方差分析，方差齐用SNK法或LSD法，方差不齐用Dunnett's T3法或Tamhan's T2法；不符合正态分布的用K Independent Samples法比较多个独立样本。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 艾灸对模型大鼠胃黏膜组织损伤指数的影响

与正常组比较，模型组大鼠胃黏膜组织UI明显升高（P<0.01）；与模型组比较，艾灸模型组大鼠胃黏膜组织UI明显降低（P<0.01）；与艾灸模型组比较，艾灸+脊髓横断组大鼠胃黏膜组织UI明显升高（P<0.01）。结果见表1。

4.2 艾灸对模型大鼠胃黏膜组织表皮生长因子和血清白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α含量的影响

与正常组比较，模型组大鼠胃黏膜组织EGF和血清IL-1β、TNF-α含量明显升高（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，艾灸模型组大鼠胃黏膜组织EGF含量明显升高（P<0.01），大鼠血清IL-1β、TNF-α含量明显降低（P<0.05，P<0.01）；与艾灸模型组比较，艾灸+脊髓横断组大鼠胃黏膜组织EGF含量明显降低（P<0.01），大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明显升高（P<0.05，P<0.01）。结果见表2。

4.3 艾灸对模型大鼠胃黏膜组织热休克蛋白70蛋白表达的影响

与模型组比较，艾灸模型组和艾灸+脊髓横断组大鼠胃黏膜组织HSP70蛋白表达明显增加（P<0.01），艾灸+脊髓横断组HSP70蛋白表达较艾灸模型组降低（P<0.05）。结果见表3、图1。

5 讨论

艾灸具有行气止痛、通经活络、温经散寒等功效。足三里是脏腑中胃的下合穴，又是经络中足阳明胃经的合穴，故在针灸治疗胃肠道疾病方面，足三里常常被用作首要穴位。有研究显示，电针家兔足阳明胃经上的穴位进行治疗发现，该经脉上的穴位均会对家兔胃黏膜产生不同的保护效应，而在这些穴位中，“足三里”对胃黏膜的保护效应最佳[4]。在机体胃黏膜受到损伤及修复过程中，机体进行自我保护机制最重要的是内源性保护机制，该机制的本质是机体适应性反应引发机体内源性保护物质的出现，多种生长因子和细胞因子参与了胃黏膜上皮损伤修复的调节。

EGF是一种内源性因子，能抑制胃酸、胃蛋白酶分泌，防止溃疡的形成，具有促胃黏膜上皮细胞迁移和增殖的作用[5-6]，故EGF在修复机体受损伤的胃黏膜方面发挥着至关重要的作用。在本实验中，艾灸模型组和艾灸+脊髓横断组大鼠胃黏膜组织EGF含量较模型组均有不同程度的上升，而艾灸+脊髓横断组大鼠胃黏膜组织EGF含量较艾灸模型组降低，表明艾灸上调胃黏膜组织EGF含量的作用受到脊髓横断术的影响。

IL-1β具有促进机体的炎性细胞因子表达，并能促进机体中性粒细胞浸润的作用。TNF-α也是一种炎性介质，可引起机体产生炎症反应。本实验结果表明，艾灸作用于胃黏膜受到损伤的大鼠能降低大鼠血清炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的含量，通过减轻炎症反应达到保护大鼠胃黏膜的作用。而大鼠脊髓遭到横断后，艾灸作用于大鼠反而会上升大鼠血清IL-1β和TNF-α的含量。表明艾灸大鼠“足三里”通过细胞因子来保护胃黏膜的这一作用有脊髓的参与。

HSP70是胃黏膜保护中一类重要蛋白，具有细胞蛋白自稳、协同免疫、抗细胞凋亡、抗氧化等作用。研究发现，艾灸能够保护应激性胃黏膜受损伤大鼠的胃黏膜，这一保护过程可能与艾灸诱导大鼠胃黏膜组织HSP70表达有关[7]。HSP70在长时间乙醇和阿司匹林刺激胃黏膜后以及高热后的表达明显增加，能够产生机体适应性的细胞保护作用[8-9]。

本实验将大鼠脊髓横断观察艾灸大鼠“足三里”对胃黏膜受损大鼠的抑制作用及对大鼠胃黏膜修复的保护作用。结果表明，艾灸大鼠“足三里”对大鼠胃黏膜损伤具有明显的保护作用，而脊髓横断术对其保护作用产生干扰。表明脊髓是艾灸对大鼠胃黏膜相关因子及HSP70表达进行调节的重要途径，脊髓是艾灸“足三里”对胃黏膜保护效应信号通路的一部分，起到重要的信号汇聚与整合的作用。

参考文献：

[1] 杜燕，易受乡，林亚平，等.艾灸对急性胃黏膜损伤大鼠热休克蛋白与相关炎性细胞因子的影响[J].上海针灸杂志，2010，29（5）：269-272.

[2] 易受乡，彭艳，常小荣，等.艾灸对应激性胃黏膜损伤大鼠胃黏膜细胞增殖和凋亡的影响及其与热休克蛋白表达关系的研究[J].针刺研究， 2006，31（5）：259-271.

[3] 李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2007：255-257.

[4] 严洁，常小荣，邓元江，等.电针足阳明经穴对家兔胃黏膜损伤细胞保护作用的研究[J].针刺研究，2001，26（4）：264-269.

[5] 姒健敏.关注生长因子对胃黏膜的保护作用[J].中华医学杂志，2005， 85（39）：2744-2745.

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[9] ITOH Y H， NOGUCHI R. Pre-treatment with mild whole-body heating prevents gastric ulcer induced by restraint and water-immersion stress in rats[J]. Int J Hyperthermia，2000，16：183-191.