曲古霉素A诱导胃癌细胞系BGC-803凋亡的机制研究

林彬

曲古霉素A诱导胃癌细胞系BGC-803凋亡的机制研究

林彬

目的利用曲古霉素A(TSA)处理人胃癌细胞系BGC-803后观察细胞增殖情况并研究了凋亡相关基因表达量的变化。方法本研究通过TSA处理胃癌细胞系BGC-803细胞后，利用MTT、Real-time PCR、Western blot等试验方法，采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。结果75 ng/mL的TSA处理48 h相较其他试验组，可显著抑制胃癌细胞系BGC-803细胞增殖(P＜0.05)，且其抑制作用具有剂量、时间依赖性；使促凋亡蛋白BAX、Caspase-3的mRNA、蛋白表达量升高，从而发挥促进细胞凋亡的作用。结论TSA诱导BGC-803调亡是通过Caspase依赖途径进行的，且随着时间和剂量的增加，TSA对胃癌细胞的抑制效果越来越显著。

曲古霉素A；BGC-803；细胞调亡；Bax；Caspase-3

胃癌患者占全球癌症患者的8%，其死亡率占到全球癌症死亡率的10%[1]，癌症的发生、发现、发展涉及的因素非常多，环境与遗传因素之间的相互作用以及阶段多态的复杂多样性，对于早期胃癌手术治疗效果比较理想，但是，如果对于中晚期胃癌，一些常规的手术治疗以及放化疗方法效果往往不理想，这就需要医学科研工作者继续探究更为有效的切入点，从分子细胞学层面探究胃癌发生机制，为患者带来更好的治疗效果。

去乙酰化转移酶抑制剂是一类化合物，近年的研究发现，去乙酰化转移酶抑制剂通过增加细胞的乙酰化程度来提高相关基因的表达水平，可明显抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡、分化以及细胞周期阻滞，基于此项发现，使其成为一种新的肿瘤治疗制剂。科研人员已对各种乙酰化转移酶抑制剂对肿瘤细胞的作用和机制进行了广泛研究，也证实对肿瘤细胞迁移、侵袭、转移的抑制作用和抗肿瘤血管生成作用。曲古霉素A(TSA)是目前研究发现的最广泛去乙酰化转移酶抑制剂之一，研究发现TSA对肿瘤细胞有明显的抑制作用[2-5]，但TSA是如何对胃癌细胞产生抑制作用的，其机制尚不清楚。本研究利用TSA处理人胃癌细胞系BGC-803后观察细胞增殖情况；并研究了凋亡相关基因表达量的变化，为TSA进一步应用于临床治疗胃癌提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 细胞培养人胃上皮癌BGC-803细胞系，采用RPMI-1640培养基，其中含有10%(v/v)胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素。37℃、5%CO2湿润环境中培养。

1.2 细胞增殖实验取对数生长期的BGC-803细胞，制成细胞悬液，以1×105/mL的浓度接种于96孔板中，用浓度为0 ng/mL(对照组)、37.5 ng/mL和75 ng/mL的TSA分别作用24 h、36 h、48 h和72 h。每孔加入10 μL MTT(6 g/L)，继续孵育4 h，除去培养基后，每孔加入二甲基亚砜和乙醇的混合液(1∶1)，振荡10 min直到晶体完全溶解。利用酶标仪测定550 nm波长处的A值，每组试验3次重复。细胞生长抑制率(%)＝(对照组吸光度－实验组吸光度)/对照组吸光度×100%。重复实验3次取平均值。

1.3 反转录和Real-time PCR计数经浓度为0 ng/mL(对照组)和75 ng/mL的TSA处理48 h的BGC-803细胞各1×107个，利用Trizol提取各细胞总RNA，3种细胞各取总RNA 800 μg进行反转录，PCR扩增BAX、Caspase-3、Bcl-2、Myc(同时扩增β-actin作为内参)，引物序列(表1)。实时荧光定量PCR反应条件：95℃30 s(95℃5 s，60℃20 s)45个循环，95℃10 s，65℃10 s，40℃30 s。

表1 引物序列

1.4 Western blot计数经浓度为0 ng/mL(对照组)、75 ng/mL的TSA处理48 h的BGC-803细胞各1×108个，离心(4℃，1 000 g，5 min)。用冰冷的PBS冲洗两次，加入裂解液溶解细胞，离心(4℃，1 500 g，10 min)，取上清液。每个样品取80 μg总蛋白进行常规SDS-PAGE电泳，蛋白浓度采用BCA试剂盒测定。经电泳后转移至PVDF膜，4℃条件下5%脱脂奶粉封闭PVDF膜过夜，一抗经5%脱脂奶粉稀释后加于膜上，4℃条件下孵育过夜；用TBST缓冲液洗膜5 min×4次；加二抗室温孵育2 h，TBST缓冲液洗膜5 min×4次，滴加ECL试剂后立即成像。

1.5 统计学方法采用SPSS 17.0统计软件分析数据，数据用(±s)表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TSA对胃癌细胞系BGC-803增殖的影响实验结果显示，37.5 ng/mL、75 ng/mL TSA均可抑制胃癌细胞系BGC-803增殖，其抑制作用具有剂量、时间依赖性，且各时间点的抑制率均显著高于对照组(表2)。其中，75 ng/mL TSA处理48 h的增殖抑制率最高(53.11%)。

表2 TSA对胃癌细胞系BGC-803增殖的影响

2.2 TSA对凋亡相关基因mRNA表达量的影响与对照组相比，75 ng/mL的TSA处理48 h后可使BGC-803细胞中的促凋亡因子Bax、Caspase-3的mRNA表达量显著下降(P＜0.05)，但Bcl-2、Myc的mRNA表达量没有变化(图1)。

2.3 TSA对Bax、Caspase-3蛋白表达量的影响与对照组相比，75 ng/mL的TSA处理48 h后可使BGC-803细胞中的促凋亡因子Bax、Caspase-3的蛋白表达量显著下降(图2)。说明TSA可通过减少促凋亡因子Bax、Caspase-3在mRNA和蛋白水平上的表达量，发挥抑制BGC-803细胞增殖的作用。

图1 TSA对凋亡相关基因mRNA表达量的影响

图2 TSA对Bax、Caspase-3蛋白表达量的影响

3 讨论

TSA是一种组蛋白乙酰基转移酶和去乙酰化酶(HDAC)的抑制蛋白，能抑制细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡[6-8]。Bcl-2家族是一类重要的凋亡调控蛋白，在内源性细胞凋亡途径中发挥重要作用。其中，Bax是促进凋亡的蛋白，而Bcl-2是抑制细胞凋亡的蛋白，在一定程度上，Bcl-2和Bax的表达程度决定细胞的生死，Bax占优势时细胞凋亡，激活Caspase级联反应；Bcl-2占优势时抑制细胞凋亡。细胞凋亡，从传递凋亡信号，到发生Caspase级联反应，再到蛋白底物裂解，细胞解体为结束标志，从而完成细胞凋亡[9-10]。除少数细胞凋亡通路是非Caspases依赖性的，绝大部分细胞凋亡信号传递都最终激活Caspase的级联反应，正是Caspase的激活才导致细胞凋亡的最终事件。

本研究发现，TSA处理BGC-803细胞后可导致Bax和Caspase-3的表达量下降，从而发挥促进BGC-803细胞细胞凋亡的作用。Bax促进细胞凋亡的作用主要是通过加速线粒体中cyt-c释放和增强Caspase活性来实现的。有研究报道，Bax在胃癌组织中的表达量增加[11-12]，本研究发现，Bax在胃癌细胞系BGC-803细胞中的表达量显著低于在凋亡的BGC-803细胞中的表达量，与之前研究结果一致。胃癌组织中Bax表达量低时，可能会使细胞凋亡减少，导致胃黏膜细胞中一些DNA受损的细胞逃避正常的细胞凋亡机制而快速增殖，最终成为癌细胞。在临床实践中，胃癌、结肠癌中经常发生Bax基因的错义突变，导致Bax蛋白分子中苏氨酸被丙氨酸或蛋氨酸代替，使Bax蛋白抑制细胞凋亡的能力降低，最终引起肿瘤的发生。Caspases家族有促进细胞凋亡的作用，在恶性肿瘤组织中Caspases家族中的Caspase-3蛋白呈低表达状态。本研究证实了Caspase-3在凋亡的和正常的BGC-803细胞中的表达量差异显著。恶性肿瘤发生原因之一就是Caspase-3的表达量降低、肿瘤细胞的细胞凋亡受到抑制，使肿瘤细胞的生长呈现出近似于无限趋势。

4 结论

TSA诱导BGC-803调亡是通过Caspase依赖途径进行的，且随着时间和剂量的增加，TSA对胃癌细胞的抑制效果越来越显著。但TSA对胃癌细胞的抑制作用机制比较复杂，这个过程涉及多个基因且具有选择性，TSA并不能抑制所有促进细胞生长基因的表达，同样也不能促进所有细胞凋亡基因的表达。TSA通过何种途径识别正常细胞与癌细胞，并使其对正常细胞的抑制作用小很多，是今后研究的重要方向之一。

[1]Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancerstatistics[J].CaACancerJournalforClinicians，2011，61(2)：69-90.

[2]Kim JS，LeeSC，MinHY，etal.Activationof insulin-like growth factor receptor signaling mediates resistance to histone deacetylaseinhibitors[J].CancerLetters，2015，361(2)：197-206.

[3]Turtoi A，Peixoto P，Castronovo V，et al.Histone deacetylases andcancer-associatedangiogenesis：currentunderstandingof the biology and clinical perspectives[J].Critical Reviews in Oncogenesis，2015，20(1-2)：119-137.

[4]Zhang J，WeiW，JinHC，etal.Programmedcelldeath2 protein induces gastric cancer cell growth arrest at the early S phase of the cell cycle and apoptosis in a p53-dependent manner[J].Oncology Reports，2015，33(1)：103-110.

[5]BergerSL.Histonemodificationsintranscriptionalregulation[J].CurrentOpinioninGenetics&Development，2002，12(2)：142-148.

[6]ChatterjeeN，Wang WL，ConklinT，etal.Histonedeacetylase inhibitors modulate miRNA and mRNA expression，block metaphase，and induce apoptosis in inflammatory breast cancer cells[J].Cancer Biology&Therapy，2013，14(7)：658-671.

[7]Chen CQ，Chen CS，Chen JJ，et al.Histone deacetylases inhibitorTrichostatinAincreasestheexpressionof Dleu2/miR-15a/16-1 via HDAC3 in nonsmall cell lung cancer[J].Molecular&CellularBiochemistry，2013，383(1-2)：137-148.

[8]Liu Y，He G，Wang Y，et al.MCM-2 is a therapeutic target of Trichostatin A in colon cancer cells[J].Toxicol Letters，2013，221(1)：23-30.

[9]Zhai Y，Ding D，Wei L，et al.RETRACTED ARTICLE：InterferenceofMucin1inhibitsthegrowthoflivercancer cellsbyinducingmitochondria-mediatedanddeathreceptor-mediated cell apoptosis[J].Tumor Biology，2015，36(2)：559.

[10]TakataA，TerauchiM，HiramitsuS，etal.Dkk-3induces apoptosis through mitochondrial and Fas death receptor pathwaysinhumanmucinousovariancancercells[J].International Journal of Gynecological Cancer Official Journal of the InternationalGynecologicalCancerSociety，2015，25(3)：372-379.

[11]陈忠其，陆玲，冯建洪，等.Bcl-2、Bax在胃癌与癌前病变组织中的表达[J].实用临床医学，2015，16(8)：13-14.

[12]杨洪颖，张文军，左燕红.胃癌组织中Ezrin表达与Bcl-2/Bax关系及其预后[J].解放军医药杂志，2015(1)：78-81.

ObjectiveTo observe the cell multiplication status after dealing with human gastric cancer cell line BGC-803 by means of Trichostatin A(TSA)，and to study the changes of apoptosis related gene expression quantity.MethodsAfter dealing with human gastric cancer cell line BGC-803 by means of TSA，the study adopted test methods of MTT，Real-time PCR，and Western blot and SPSS 17.0 statistical software to conduct data analysis.Results Compared with other experimental groups，48 h of 75 ng/mL TSA treatment could significantly inhibit the cell multiplication of gastric cancer cell line BGC-803(P＜0.05)，and the inhibitory effect bears dose and time dependence.It promoted pro-apoptotic protein BAX，mRNA of Caspase-3，and protein expression，which consequently exerted the function of promoting apoptosis.ConclusionTSA induced gastric cancer cell line BGC-803 apoptosis is carried out through Caspase-dependent pathway，and with the increase of time and dose，TSA shows increasingly significant inhibitory effect on gastric cancer cells.

Trichostatin A(TSA)；BGC-803；Apoptosis；Bax；Caspase-3

2016-04-26)

1005-619X(2016)10-1016-03

10.13517/j.cnki.ccm.2016.10.003

110015辽宁电力中心医院普外科