超声波法提取铁甲草中黄酮的工艺研究

陈梓云

超声波法提取铁甲草中黄酮的工艺研究

陈梓云

（嘉应学院化学与环境学院，广东 梅州 514015）

以芦丁为标样，采用分光光度法定量测出铁甲草中总黄酮含量，在单因素试验的基础上，用正交试验法L9（34）对铁甲草中黄酮的提取工艺进行了优选。其最佳工艺条件为：乙醇浓度60%，液固比20∶1，超声时间40min，超声温度40℃。在此条件下，黄酮提取率为12.52%。

超声波；铁甲草；黄酮

铁甲草，本名为圣蕨（Dietyocline gliffithii More），又名含羞草决明（或山扁豆，Cassia Mimosoides Linn），属蕨类金星蕨科植物，主要分布于东北、华北、西北、华东、中南、西南和台湾等地。据记载，铁甲草是民间用于防治肝炎、肝硬化的常用草药，具有清热解毒、消炎、祛暑、祛湿、利尿、解酒、化积之功效，人们称之为“肝病的克星”。因此，研究开发铁甲草的药用及食用价值很有意义。我们以产于梅州市本地的铁甲草为原料，研究用超声波法提取铁甲草中有效成分——黄酮的工艺，旨在探索一种简单、低成本、快速、有效的方法，为铁甲草的进一步开发利用提供理论依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

KUDOS SK2510HP超声仪，SHB-B95真空泵，FA1004电子天平，Human Power Ⅱ+超纯水器，SHIMADZU UV-2401PC紫外可见光分光光度计等。

芦丁标准品（AR），铁甲草（梅州市蕉岭县），乙醇（AR），硝酸铝（AR），亚硝酸钠（AR），氢氧化钠（AR）等。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁标准溶液的配制

准确称取经真空60℃干燥至恒重的芦丁标准试剂0.02g，用60%（体积比）乙醇于60℃水浴中溶解，并定量转入100mL容量瓶中，用60%乙醇定容，摇匀，记录数据。

1.2.2 测定波长的确定

准确移取芦丁标准溶液10.0mL于50mL容量瓶中，加入60%乙醇定容至25.0mL，然后加入5% NaNO2溶液1.5mL，摇匀，放置6min。再加入10% Al（NO3）3溶液1.5mL，摇匀，再放置6min。加1.0mol·L-1NaOH溶液20.0mL，用去离子水稀释定容至50.0mL，摇匀，放置10～15min后，以空白试剂作参比，使用分光光度计对工作溶液在波长350～600nm区间进行连续方式扫描［1-3］，读取吸光值，确定最大吸收峰，从而可以确定本实验的测定波长为508.80nm。

1.2.3 芦丁标准曲线的绘制

分别取1.2.1项芦丁标准溶液2.5、5.0、10.0、15.0、20.0mL于5个50mL容量瓶中，分别准确加入60%乙醇稀释成25.0mL。先加入5% NaNO2溶液1.5mL，摇匀，放置6min；再加入10% Al（NO3）3溶液1.5mL，摇匀，再放置6min；加1.0 mol·L-1NaOH溶液20.0mL，用水稀释至50.0mL，摇匀，放置10～15min后，在最大吸收波长处测定吸光度A，并对数据进行处理，作芦丁溶液浓度-吸光度图（图1），得出标准工作曲线y=11.407x+0.0140。

2 结果与讨论

图1 芦丁标准溶液浓度-吸光度图Fig.1 Absorbance of Rutin standard solution

采用超声波法提取铁甲草中黄酮，具体实验步骤为：取铁甲草，捣碎，烘干磨成粉末（过0.42mm筛），准确称取1.0g于100mL圆底烧瓶中，以乙醇为溶剂按一定液固比浸润，将圆底烧瓶置于超声仪中用59kHz超声波处理一定时间后抽滤，得铁甲草中总黄酮提取物的样品溶液，用所对应浓度的乙醇定容至50mL，放置一段时间后，取上层清液5.00mL于50mL容量瓶中，按1.2.3项下所用的方法，以空白试剂为参比，用1cm比色皿在最大吸收波长处测其吸光度，并计算样品溶液的浓度及黄酮含量。

因超声波法提取铁甲草中黄酮类化合物，受到乙醇浓度、液固比、超声时间、超声温度等几个重要因素的影响，为此，先进行单因素实验，然后再采用L9（34）正交表设计实验，从而探讨最佳实验条件以获得最大提取率。

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度的确定

准确称取l.0g铁甲草粉末，液固比20∶1，分别以20%、40%、60%、80%、95%的乙醇在60℃下超声提取30min，抽滤，按1.2.3项的方法定容到50mL容量瓶中，测定其黄酮提取率，根据实验数据作图，结果见图2。

从图2可知，乙醇浓度在40%～80%时， 有较高的提取率，其中，80%乙醇下的提取率最大，当乙醇浓度大于80%以后，黄酮提取率降低。较高乙醇浓度有利于提高黄酮提取率，但高浓度乙醇使其他醇溶性杂质的溶出增多，有效成分溶出减少。

2.1.2 液固比的确定

图2 乙醇浓度对提取率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction rate

准确称取1.0g铁甲草粉末，液固比分别为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，在60℃下以60%乙醇超声波提取30min，抽滤，按1.2.3项的方法定容到50mL容量瓶中，测定其黄酮提取率，根据实验数据作图，结果见图3。

图3 液固比对提取率的影响Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate

从图3可知，液固比在20∶1和25∶1时，有较高的提取率，其中，液固比在25∶1下的提取率最大，当液固比在10∶1、15∶1、25∶1时，有明显的上升趋势，当液固比为30∶1时，黄酮提取率有所降低。可能是由于黄酮基本溶出完全，增加溶剂量反倒使得某些醇溶性物质溶出影响黄酮的提取率。

2.1.3 超声时间的确定

液固比20∶1，在60℃下以60%乙醇分别超声回流10、20、30、40、50min，抽滤，按1.2.3项的方法定容到50mL容量瓶中，测定其黄酮提取率，根据实验数据作图，结果见图4。

图4 超声时间对提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction rate

从图4可知，超声时间在10、20、40、50min时对提取率的影响不大，当超声时间在30min时，提取率最大。这可能是黄酮类化合物在某一时间段细胞内外已达平衡，但是随着时间的增加，其他物质溶出从而影响黄酮的提取率。

2.1.4 超声温度的确定准确称取l.0g铁甲草粉末，液固比20∶1，分别于40、50、60、70、80℃下以60%乙醇超声提取30min，抽滤，按1.2.3项的方法定容到50mL容量瓶中，测定其黄酮提取率，根据实验数据作图，结果见图5。

图5 超声温度对提取率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate

从图5可知，超声温度在50℃时，有较高的提取率，当超声温度在40～50℃时，有明显的上升趋势，当超声温度超过50℃，黄酮提取率有所降低。这可能是由于温度的升高，部分黄酮类化合物被氧化，此外，温度升高，易导致其它易溶物溢出量增加，同样可导致总黄酮提取率的降低。

2.2 正交实验

设计4因素3水平的正交实验，选择乙醇浓度、液固比、超声时间和超声温度为实验因素，以黄酮提取率为实验指标，选用L9（34）正交组合进行实验，具体因素水平见表1。

表1 因素水平表Table 1 The form of factors level

2.3 最佳提取工艺条件的确定

根据单因素实验中实验数据作图，得出超声波法最佳实验条件的区域，从而采用L9（34）正交法设计因素水平表（表2）。

超声波法提取铁甲草中黄酮含量的条件实验结果记录见表2。

表2 L9（34）正交设计表Table 2 L9（34）Orthogonal design table

极差分析表明，超声波法影响黄酮提取率的主次因素为超声时间＞超声温度＞乙醇浓度＞液固比，所以最佳提取工艺为A2B2C3D1，即60%乙醇，液固比20∶1，时间40min，超声温度40℃。

2.4 铁甲草中黄酮含量分析

以芦丁为标样，在最佳工艺条件下独立平行测定5次，计算黄酮类化合物的总量，得出铁甲草黄酮提取液测定结果见表3。

表3 黄酮含量的平行实验Table 3 The parallel experiments of Flavonoids Content

从表3的数据可知，在该条件下测定的黄酮提取率基本稳定，相对平均偏差较小，可信度较高，由此可以判定，在超声波最佳工艺条件下测定黄酮的含量为12.52%。

3 结论

以芦丁为标样，采用分光光度法定量测出铁甲草中总黄酮含量，在单因素试验的基础上，用正交试验法L9（34）对铁甲草中黄酮的提取工艺进行了优选。超声波法影响黄酮提取率的主次因素为超声时间＞超声温度＞乙醇浓度＞液固比，其最佳工艺条件为60%乙醇，液固比20∶1，时间40min，超声温度40℃，在最佳工艺条件下，超声波提取法对铁甲草的黄酮提取率为12.52%。分析认为，超声波技术对遇热不稳定、易水解或氧化的黄酮有效成分具有保护作用，有利于后期的分离和纯化。如今超声波技术发展较为成熟，设备的维护和保养比较方便，操作简单易行，其作为一种先进的提取方法，应用在铁甲草中黄酮的提取和纯化，具有广阔的前景［4-5］。

［1]吕帮玉，杨新河.超声波提取山楂叶总黄酮的工艺研究［J］.安徽农业科学，2008，36（3）：845-846.

［2]刘振南.用正交法探讨山楂叶中黄酮类化合物的乙醇提取工艺［J］.广西民族学院学报：自然科学版，1999（3）：27-28.

［3]汪洪武，刘艳清.正交试验法优选水泽兰总黄酮提取工艺研究［J］.中药材，2006，29（9）：977-979.

［4]齐丽霞，郑彦峰，谈锋.银杏叶总黄酮提取方法的比较研究［J］.江西农业学报，2007，19（1）：80-83.

［5]张珊珊，赵晓红.不同提取方法对北京市早园竹叶黄酮提取效率比较［J］.食品科技，2008（3）：167-170.

Ultrasonic Extraction of Flavonoids in Dietyocline Gliffithii More

CHEN Zi-yun
（School of Chemistry and Environment， Jiaying University， Meizhou 514015， China）

As a quantitative analysis method， spectrophotometer was used to measure the total flavonoids content in dietyocline gliffithii more. Based on single-factor tests， the conditions of flavonoids extraction were optimized by orthogonal method L9（34）. The optimum conditions were as followed： ethanol concentrations 60%， liquid-solid ratio was 20：1， ultrasonic time was 40min and ultrasonic temperature was 40℃. Under such conditions， the extraction rate of flavonoids was up to 12.52%.

ultrasonic； dietyocline gliffithii more； flavonoids

R 284.2

A

1671-9905（2016）03-0018-04

陈梓云（1963-），男，汉，重庆云阳人，教授，硕士，主要从事应用化学教学与研究，电话：18607530829，E-mail：chenzy@ jyu.edu.cn

2016-01-07