慢性乙型肝炎患者病毒基因组与乙型肝炎病毒e抗原、肝功能关系分析

刘振杰，曹永坚，岑子华，徐　宁△

(1.广东省中医院芳村医院检验科，广州 510370；2.中山大学医学院2008级医学检验，广州 510080)



·论著·

慢性乙型肝炎患者病毒基因组与乙型肝炎病毒e抗原、肝功能关系分析

刘振杰1，曹永坚1，岑子华2，徐宁1△

(1.广东省中医院芳村医院检验科，广州 510370；2.中山大学医学院2008级医学检验，广州 510080)

摘要:目的探讨乙型肝炎病毒基因组 (HBV-DNA)、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、肝功能的相关关系，为临床治疗提供参考。方法回顾分析401例患者的HBV-DNA、HBeAg、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平，对HBV-DNA与HBeAg进行相关性分析。根据患者的HBV-DNA、HBeAg水平进行分组，比较各组的ALT、AST水平差异。结果(1)HBV-DNA与HBeAg的阳性率存在相关性，相关系数r=0.671(P<0.01)；(2)HBV-DNA载量达105 copies/mL时，血清ALT、AST较HBV-DNA阴性组及低载量组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；(3)在HBV-DNA载量相当时，HBeAg阳性组与阴性组ALT、AST活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论(1)HBeAg与HBV-DNA具有相关性；(2) HBV-DNA载量较高的患者容易出现肝功能异常；(3)HBeAg的存在情况与肝功能无显著相关性。

关键词:乙型肝炎病毒基因组；乙型肝炎病毒e抗原；丙氨酸氨基转移酶；天冬氨酸氨基转移酶

乙型肝炎是一种常见传染病，据估计全球3.5亿人感染乙型肝炎病毒(HBV)，HBV与肝硬化、原发性肝癌密切相关，每年有一百万人死于有关疾病[1]。目前，认为乙型肝炎对肝的损害是由于HBV引起细胞免疫针对受感染肝细胞的清除，病情的转归涉及HBV的体内复制情况和机体的免疫状况。HBV基因组(HBV-DNA)载量、HBV血清标志物和血清转氨酶是监测HBV感染情况的常用指标。了解三者之间的相关关系及临床应用的代表性有其意义。本文旨在研究三者在慢性乙型肝炎患者中的联系，为临床提供指导意义。

1资料与方法

1.1一般资料401例血清标本收集自2013年2月1日至2013年3月15日在广东省中医院系统(包含大德路总院、芳村分院、二沙岛分院、大学城分院)同时作HBV-DNA、乙型肝炎两对半定量、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)检测的门诊及住院患者，排除溶血、黄疸、脂血标本。诊断标准参照《慢性乙型肝炎防治指南(2010版)》[2]。其中男273例，女128例，年龄12～77岁，平均(37±12)岁。

1.2仪器与试剂血清ALT、AST由两套检测系统测定：罗氏Modular全自动生化分析位仪购自德国罗氏公司，采用罗氏配套试剂、校准品、伯乐质控品；罗氏Cobas 8000全自动生化分析仪，采用配套试剂、校准品、伯乐质控品。两套系统均通过室间质评；ABI 7300自动基因扩增检测仪购自美国ABI公司，HBV-DNA荧光定量试剂盒由广州中山大学达安基因股份有限公司生产；罗氏e 601化学发光分析仪购自德国罗氏公司，采用罗氏配套试剂、校准品、伯乐质控品。

1.3方法

1.3.1ALT活性测定以速率法测定。ALT催化L-丙氨酸和2-酮戊二酸产生丙酮酸，丙酮酸在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)存在下生成L-乳酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，NADH的反应速率与ALT的活性成正比，在340 nm波长处可检测到吸亮度的降低。测试系统以测定值大于50 IU/L为阳性。

1.3.2AST活性测定以速率法测定。AST催化L-精氨酸与天门冬氨酸产生L-谷氨酸与草酰乙酸，草酰乙酸在苹果酸脱氢酶存在下与NADH反应生成L-乳酸和NAD，反应速率和AST的活性成正比，在340 nm波长处检测到吸亮度的降低。AST测试系统以测定值大于40 IU/L为阳性。

1.3.3血清HBVe抗原(HBeAg)定量测定用电化学发光法测定。测试原理利用双抗体夹心法，先将待测血清、生物素化抗HBeAg单克隆抗体、钌标记抗乙型肝炎e(HBe)混合，形成夹心复合物，再加入链霉素亲和素微粒，通过生物素-亲和素结合使微粒结合在复合物上，在测量池中用磁铁吸附复合物，同时洗去未形成复合物，加电压发光并由光电倍增管检测，通过计算器运算结果，以cut-off值大于或等于1判为阳性。

1.3.4乙型肝炎DNA定量测定用荧光定量聚合酶链反应(PCR)测定。严格按照试剂盒说明书进行操作，主要技术步骤为血清中HBV-DNA提取，PCR反应条件为93 ℃ 2 s→93 ℃ 45 s→55 ℃ 60 s进行10次循环，再以93 ℃ 30 s→55 ℃ 45 s进行30次循环。以HBV-DNA≥500 copies/mL作阳性判断临界值。以HBV-DNA载量分为3个水平：DNA阴性组 (HBV-DNA<500 copies/mL)、DNA低载量组(500 copies/mL≤HBV-DNA<105copies/mL)、DNA高载量组(HBV-DNA≥105copies/mL)；同时以HBeAg定性结果分为HBeAg阳性组(S/CO≥1)和HBeAg阴性组(S/CO<1)，共6组。

1.3.5数据查询登录怡捷实验室数据处理系统，以1.1中标准查询并记录患者的ALT、AST、HBeAg定量及HBV-DNA定量检测结果。

2结果

2.1HBeAg阳性率与HBV-DNA阳性率的关系HBeAg阳性200例，其中HBV-DNA阳性121例，HBV-DNA阴性79例；HBeAg阴性201例，其中HBV-DNA阳性69例，HBV-DNA阴性132例。两者比较差异有统计学意义(χ2=27.54，P<0.01)，两者的阳性率相关。

2.2HBeAg定量与HBV-DNA定量的相关关系为进一步研究两者间的相互关系，以HBV-DNA定量和HBeAg定量作统计量，计算两者Pearsons相关系数。结果显示两者之间相关系数r=0.671(P<0.01)。

2.3ALT、AST与HBeAg、HBV-DNA载量关系分析经t检验后，无论HBeAg阳性或阴性，HBV-DNA低载量与HBV-DNA阴性组相比，ALT、AST差异均无统计学意义(P>0.05)；HBV-DNA高载量与HBV-DNA阴性组、HBV-DNA低载量组相比，ALT、AST差异均有统计学意义(P<0.05)。在HBeAg定性结果不同但同等病毒载量下，各组相比，ALT、AST差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　不同载量HBV-DNA及HBeAg组ALT、AST的水平

续表1　不同载量HBV-DNA及HBeAg组ALT、AST的水平

3讨论

目前，HBV-DNA检测是最特异的针对HBV在体内复制情况的指标，但由于其成本较高，对仪器设备要求苛刻的关系，部分医疗机构难以推广。血清转氨酶和乙型肝炎血清标志物均是与乙型肝炎密切相关的指示物，方法学上更简单，应用较广，但两者代替HBV-DNA的监察作用的合理性则存在疑问。本文对HBeAg与HBV-DNA的相互关系作出分析，发现HBV-DNA检测结果为阳性的患者，其HBeAg检测阳性率高于HBV-DNA检测结果为阴性的患者，两者间差异有统计学意义(P<0.01)，说明HBV-DNA与HBeAg的发生率具有相关性。在进一步的相关性检验中，以两者的绝对数量为坐标轴作散点图，统计后得出两者的Pearsons相关系数r=0.671(P<0.01)，说明两者在数量上呈正相关。有报道指出，高病毒负荷的患者易转慢性化[3-4]，而Milich等[5]的研究指出，HBeAg的存在能干扰CD8-CTL的细胞毒作用，诱导机体对HBV的免疫耐受，两者指出HBV-DNA和HBeAg对乙型肝炎慢性化都具有预警作用，而此结果显示以HBeAg作为HBV-DNA复制的指标的确有一定根据，在缺乏其他资料支持下，HBeAg具有提示的作用。纵然如此，建立HBeAg与HBV-DNA的关系仍有不少问题目前难以克服，从相关性分析中可得知两者数量不构成平行关系。本研究中发现，79例HBeAg阳性患者HBV-DNA水平为阴性，可能与慢性乙型肝炎的自然病史有关，在免疫清除期后期或低活动期前期机体免疫系统被激活，开始清除病毒颗粒，结果是病毒载量的减少。同时，血清转换在该时期尚未完成，患者仍然表达HBeAg[6]。利用HBeAg的另一盲点是无法评估HBeAg阴性乙型肝炎患者。由于HBV转录酶缺乏修饰功能，翻译中易发生突变。HBeAg可有数种途径，主要的有：(1)前C区的1 896位的G-A变异，使终止子抗胸腺球蛋白出现，病毒不能表达HBeAg，但并不影响DNA的复制[7]；(2)HBeAg表达水平降低，核心启动子区存在T1462A和T1464A突变，使HBeAg表达水平大幅下降。以上突变只影响HBeAg的表达，并不影响HBV的复制，无法以HBeAg来说明HBV的复制情况[8]。有报道指出，HBeAg的阴性化有利于HBV逃过免疫机制[9]。一项流行调查指这类患者占总体患者21%～40%[7]。

另外，临床常用酶联免疫吸附试验(ELISA)大规模筛查可疑人群，而并非本文所用的电化学发光法。有报道指出，以电化学发光对HBeAg的最低检测限可达比ELISA高10倍以上[10]，可预期以ELISA作大规模筛查，其漏检情况更为普遍，失去提示作用，值得留意。

有关肝功能与乙型肝炎血清标志物及HBV-DNA之间的关系，不少数据曾对此作出分析，但结论分歧。本文中亦以HBV-DNA的绝对数量及HBeAg的定性检测结果分组，以便观察各基因组水平及同等基因组水平下肝损害的情况。结果显示不论基因组载量的高低，在相同HBV-DNA水平下，HBeAg阳性组与HBeAg阴性组的血清ALT、AST均差异无统计学意义(P>0.05)，说明HBeAg不影响血清ALT、AST水平，没有反映肝细胞的实质损害作用。究其原因，据文献[11-12]的报道，人体对HBV的免疫作用主要为细胞免疫，主要作用细胞是CD4Th细胞和CD8-CTL细胞，虽然HBeAg能成为CTL的靶抗原，但其不是结构蛋白，因此其作用主要是免疫耐受调节因子，不直接导致肝细胞损伤[13-15]。因此，HBeAg并非血清转氨酶异常升高的主因。文中同时研究HBV-DNA载量对肝功能的影响，结果说明在HBeAg定性检测结果一致的情况下，不论在HBeAg阳性组与HBeAg阴性组里，都存在同样现象：在HBV-DNA为阴性或水平较低(<105copies/mL)时，HBV-DNA与肝损害致ALT、AST在血中存在的关系不明显(P>0.05)；当HBV-DNA达到一定水平(>105copies/mL)时，基因组复制水平与肝功能之间有关(P<0.05)，HBV-DNA载量较高时，肝损害亦会加重，这与文献[16-18]报道一致。

综上所述，HBV-DNA、HBeAg和血清转氨酶三者分别从病毒的复制水平、免疫应答和肝细胞损害反映机体感染HBV后的状况。随着HBeAg阴性乙型肝炎的发现和乙型肝炎患者肝细胞损害的机制的了解，对三者之间是否存在紧密联系提出了质疑。本研究结果显示，用血清转氨酶和HBeAg代替HBV-DNA作为检测HBV的活动指标并不是完全没有依据，但临床应用中具有很大的局限性，并不能如实反映HBV的复制情况及传染性，因此同时作3种检查有其必要性。

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作者简介：刘振杰，男，主管技师，主要从事临床免疫学研究。△通讯作者，E-mail:xu_ning21@163.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.13.015

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)13-1784-03

(收稿日期：2016-02-18修回日期：2016-04-30)

Analysis on relation between viral genome with hepatitis B virus e antigen and liver function in chronic hepatitis B patients

LIUZhenjie1,CAOYongjian1,CENZihua2,XUNing1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,FangcunHospital,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou,Guangdong510370,China;2.Grade2008,DepartmentofMedicalLaboratory,SunYatsenUniversity,Guangzhou,Guangdong510080,China)

Abstract:ObjectiveTo study the relationship among hepatitis B viral genome (HBV-DNA),hepatitis Be antigen(HBeAg) and liver function in chronic hepatitis B patients,and to provide the reference for clinical treatment.MethodsThe quantitative levels of HBV-DNA,HBeAg,alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase(AST) in 401 patients were analyzed and the correlation analysis between HBV-DNA and HBeAg was performed.The grouping was performed according to the HBV-DNA and HBeAg quantitative levels and the differences of ALT and AST levels were compared among the groups.Results(1) The correlation existed between HBV-DNA and HBeAg positive rate,r=0.671(P<0.01);(2)when HBV-DNA load reaching 105 copies/mL,serum ALT and AST levels showed significantly increased compared with the HBV-DNA negative group and low load group,the difference was statistically significant(P<0.05);(3)when HBV-DNA load was equivalent,the difference of ALT and AST activity had no statistically significant difference between the HBeAg-positive and HBeAg-negative groups.Conclusion(1)HBeAg has a correlation with HBV-DNA;(2)the patients with higher HBV-DNA load are easy to develop the liver function abnormality;(3)the HbeAg existence situation has no obvious relation with the liver function.

Key words:hepatitis B viral genome;HBV e antigens;alanine aminotransferase;aspartate aminotransferase