福建部分地区人和动物嗜吞噬细胞无形体基因检测和序列分析

肖方震，李丹萍，徐国英，陈　阳，邓艳琴



福建部分地区人和动物嗜吞噬细胞无形体基因检测和序列分析

肖方震1，李丹萍2，徐国英1，陈阳1，邓艳琴1

1.福建省疾病预防控制中心，福建省人兽共患病研究重点实验室，福州350001；2.福建医科大学，福州350004

摘要：目的了解福建省人和动物嗜吞噬细胞无形体的感染状况以及基因特征。方法收集永春县和上杭县高危人群、家畜的全血，采用巢式PCR扩增无形体16S rRNA片段, PCR产物纯化测序并与序列比对分析。结果永春县牛的无形体感染率最高为53.85%，羊、狗无形体感染率分别为24.71%和12.50%。上杭县羊的无形体感染率为53.06%，高危人群的无形体感染率为8.33%。无形体基因序列与相应的参考序列同源性均达97%～100%。结论福建省人和动物存在嗜吞噬细胞无形体感染。

关键词：无形体；巢式PCR；16S rRNA；序列分析

Supported by the Subject of Medical Innovation of Fujian Province(No.2012-CXB-12)

人粒细胞无形体病(Human Granulocytic Anaplasmosis，HGA)是由嗜吞噬细胞无形体(Anaplasmaphagocytophilum) 引起的一种经蜱传播的自然疫源性疾病，临床表现以发热伴白细胞和血小板减少为主，严重者可进展为多脏器功能衰竭、大出血及继发感染[1-2]。

福建省森林资源丰富，蜱虫种类繁多，独有地理特征及气候条件易于蜱传疾病的传播，如不注意，人群极易被感染。为了解我省嗜吞噬细胞无形体感染情况，根据我省蜱类分布状况的历史资料，选择位于戴云山脉的永春县、武夷山脉和博平岭山脉的上杭县，对这两个地区无形体部分储存宿主以及高危人群的感染情况进行的调查研究。

1材料与方法

1.1标本来源2011—2014年期间我们在福建省永春县分别采集了65份牛、85份羊和56份狗的全血样本，同时在上杭县采集98份羊及48份林区工作人员等高危人群的全血样本，置于-80 ℃保存备用。

1.2DNA提取使用血液基因组DNA提取试剂盒(泰京生物)提取所采集样本的DNA，所有步骤按照其说明书进行。

1.3引物根据国家《人粒细胞无形体病预防控制技术指南(试行)》合成无形体引物(见表1)，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。其中Eh-out1、Eh-out2为无形体16SrRNA基因的外侧引物，HGA1和HGA2为内侧引物。

表1　无形体16S rRNA基因的引物

1.4PCR扩增先用外侧引物Eh-out1和Eh-out2进行扩增，PCR第1轮扩增反应体系中，含有Premix Taq酶12.5 μL、上下游引物各10 μmol/L、DNA模板5 μL，加无菌去离子水至总体积25 μL。扩增条件：94 ℃预变性5 min后以94 ℃变性45 s、55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min、循环40次， 72 ℃总延伸5 min。第2轮反应使用内侧引物HGA1和HGA2进行扩增，反应体系Premix Taq酶12.5 μL、上下游引物20 μmol/L、第1轮产物0.5 μL，加无菌去离子水至总体积25 μL。反应程序除循环次数为35次，其余同第1轮扩增条件。首份PCR阳性标本送上海生工生物技术公司测序，经序列比对，确定为嗜吞噬细胞无形体，其后的标本检测以此作为阳性对照。

1.5产物检测取3 μL的第2轮产物点样于1.5%的琼脂糖80 V凝胶电泳45 min，凝胶呈像系统观察结果。随机选取阳性标本纯化后送上海生工生物技术公司进行测序。

1.6序列分析测得的序列登陆美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库进行BLAST同源性比对。序列分析采用BioEdit、MEGA5.1等软件。

2结果

2.1巢式PCR扩增结果无形体16S rRNA经巢式PCR扩增得到389 bp左右的片段(见图1)，这与预期的目标条带相符。本次调查采集福建上杭县高危人群全血样本48份，结果显示无形体阳性4份，阳性率为8.33%。同时我们也对这两个地区动物感染无形体进行了检测分析，结果见表2。

M为marker(DL2000);1-9为无形体阳性标本;N为阴性对照

结果表明永春县家畜动物中，牛的无形体感染率最高为53.85%，其次为羊的感染率为24.71%，狗的感染率最低为12.50%。上杭县羊无的形体感染率为53.06%。上杭县羊的无形体感染率明显高于永春县(χ2= 15.26，P<0.05)。

2.2序列分析我们将测序的无形体阳性的样本进行同源性分析(见表3)。结果显示几个样本的同源性在97%～100%之间。其中上杭县羊血样本(SSH068y、SSH031y)、永春县羊血样本(SYC001y)以及上杭县人血样本(SH028)的无形体基因序列完全相同，同源性达到100%。永春县牛血样本(SYC002n、SYC095n)序列与羊血样本的同源性均达到了98%。但永春地区的两份牛的样本的序列同源性最低为97%。

表2　人、动物感染无形体检测结果

表3　部分无形体阳性样本基因序列同源性分析

同时，我们登陆GenBank进行Blast同源性比对，结果表明本次采集的人及动物血样所携带的无形体，其16S rRNA核酸序列与GenBank数据库中已注册的对应核酸序列具有高度的相似性。其中本次采集羊血样标本SYC001y、SSH068y、SSH031y，人血样标本SH028均与在浙江省无形体序列(GenBank No.GQ500062)相似度均为100%。SYC002n牛血样本与北京、新疆等地发现的无形体序列(GenBank No.GQ499987、GQ900613)相似度为100%。

我们选取GenBank中国内外多地的无形体的序列与本实验测序样本一起构建世系树状图。采用的是邻位相连法(Neighbor-joining)构建树状图(见图2)图中看见羊血样标本SYC001y、SSH068y、SSH031y，人血样标本SH028与浙江省的无形体序列在同一个分支，永春的牛血样标本SYC095n相对独立，SYC002n与北京、新疆和浙江等地区的序列较为接近，同时我们将序列与韩国、波兰和突尼斯等国家的分离株序列进行比对，树状图显示这些国家的分离株序列与我省无形体序列相差较远。

图2　嗜吞噬细胞无形体16s rRNA序列的系统进化树

Fig.2Phylogenetic tree based on partial 16s rRNA sequences of A. phagocytophilum

3讨论

永春县位于福建的东南部，西部系戴云山脉主体部分，上杭县地处武夷山脉南麓和博平岭山脉之间，两地均属于亚热带气候，森林资源丰富，蜱虫种类繁多，两地的地理特征和气候特别适合包括无形体病在内的蜱传疾病传播。无形体病作为新发传染病，近年日益受到重视。我国已陆续从新疆、安徽和浙江等地宿主动物和蜱虫上检测出人粒细胞无形体[3-8]。其宿主包括白足鼠、山羊、绵羊等家畜动物。本研究采集了永春县、上杭县的牛、羊和狗的血液以及高危人群中血液进行调查。结果表明上杭县羊的无形体感染率为53.06%，永春县牛、羊和狗无形体感染率分别为53.85%、24.71%和12.50%，高危人群中无形体感染率为8.33%。认为我省可能存在无形体病的自然疫源地，动物是我省无形体的重要宿主，且感染率不低。这为我省今后开展无形体病的研究提供了重要的基础。目前相关病原的分离工作陆续在开展。本研究结果也显示随着经济建设、旅游业的发展等因素的影响，我省部分人群存在一定的感染情况，推测部分的不明原因发热的病人可能就是感染无形体。而对于两个地区羊的无形体感染率差异，提示羊的无形体感染可能存在地区分布差异。但由于样本量有限，需要我们进一步扩大采集范围以及加大样本量来进一步分析。另外测序的结果显示随着地理距离的增加无形体序列的差异加大，我省无形体的序列与国内的省份特别是临近的省份如浙江省的无形体序列接近，而与韩国、波兰和突尼斯等国家的分离株序列差异较大。

加强对蜱传疾病的流行病学调查，确定宿主动物、蜱以及高危人群的感染情况，对于我们了解蜱传疾病的宿主种类、分布以及人群感染情况有着重要价值，是我省预防和控制蜱传自然疫源疾病的基础，福建处于东南沿海，有着适宜蜱传疾病存在的地理特征，同时随着对外经济交流频繁，人们生产生活活动的增加，资源的开发利用及旅游业的迅速发展，人类和蜱的接触机会日益增加，因此加强无形体病的防控是很有必要的。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.010

通讯作者：邓艳琴，Email：fjcdcdyq@163.com

中图分类号：R372

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)03-0262-04

Corresponding author:Deng Yan-qin, Email: fjcdcdyq@163.com

收稿日期：2015-06-25；修回日期:2015-10-19

Genetic identification and sequene analysis for high-risk group and animals of Anaplasma phagocytophilum infection in some areas of Fujian Province,China

XIAO Fang-zhen1,LI Dan-ping2,XU Guo-ying1,CHEN-Yang1,DENG Yan-qin1

(1.FujianCenterforDiseaseControlandPrevention/FujianPriorityLaboratoryforZoonoses,Fuzhou350001,China;2.FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China)

Abstract:To explore the nature infection and gene characteristics of Anaplasma phagocytophilum (A.phagocytophilum) in high-risk groups and animals of Fujian Province, China, blood samples from high-risk groups and animals were collected in Yongchun and Shanghang regions, for which nest polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify the fragments of 16s rRNA gene of A. phagocytophilum. In addition, the positive PCR products were sequenced and compared with the corresponding sequences acquired by biological analysis software. The infection rate of ox, goats and dogs in Yongchun region were determined to be 53.85%, 24.71% and 12.50%, and the infection rates of goats and high-risk groups in Shanghang region were 53.06% and 8.33%, respectively. The nucleotide sequence homologies of partial 16s rRNA gene for both the objective and reference sequences concurrently reached up to 97%-100%. It was concluded that A. phagocytophilum was found in some regions of Fujian Province and it should be paid more attention in the following years.

Keywords:Anaplasma phagocytophilum; nested PCR; 16S rRNA; sequence analysis

福建省医学创新课题(No.2012-CXB-12)资助