贵州地方品种鸡消化道菌群结构分析

王 凡，徐茂文，金志强，文 明*，欧德渊

(1.贵阳市动物卫生监督检验所，贵州贵阳550081；2.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025)

贵州地方品种鸡消化道菌群结构分析

王 凡1，徐茂文2，金志强1，文 明2*，欧德渊2

(1.贵阳市动物卫生监督检验所，贵州贵阳550081；2.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025)

倒毛鸡是贵州优质地方鸡种，以独有的倒羽毛而命名。试验采用聚合酶链反应-变形梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术，对40日龄倒毛鸡消化道菌群结构进行分析。结果表明：40日龄倒毛鸡消化道正常菌群为乳酸杆菌、球菌、类杆菌、真杆菌、梭菌及大肠杆菌等，其中乳酸菌分布广，而且数量众多。

倒毛鸡；消化道；菌群结构；PCR-DGGE

贵州气候适宜，物种丰富，具有优越的生态条件，拥有矮脚鸡、长顺绿壳蛋鸡、高脚鸡、黔东南小香鸡、乌蒙乌骨鸡、威宁鸡和竹香鸡等优良地方品种，有研究人员通过生化、分子等方法，对贵州地方鸡品种进行了遗传特征分析，结果表明贵州各个地方鸡品种的遗传变异丰富，具有较大的开发应用价值[1，2]。

鸡肠道内存在大量种类繁多的微生物，这些微生物参与了鸡的生长、发育、消化、吸收、营养、免疫、生物拮抗及其各种功能和结构的发生、发展及衰退的全过程，肠道中微生物区系的稳定和平衡是家禽养殖的重中之重。传统的分离培养技术不仅繁琐还不能客观反映肠道菌群的结构特征[3，4]。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，出现了微生物菌落结构新技术，如：16S rDNA基因文库、DGGE指纹图谱技术等。本试验以倒毛鸡为试验对象，使用PCR-DGGE方法进行消化道菌群结构分析，以期为贵州地方品种鸡健康养殖提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 选用40日龄倒毛鸡18只，公母各半，随机分为3个重复，每个重复6只。由贵州大学地方品种鸡养殖场提供，试验期间按统一标准饲养管理。

1.2 肠道细菌总DNA提取 采用粪便基因组DNA快速提取试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)，按照说明书进行操作，所得基因组DNA置于-20 ℃保存备用。

1.3 肠道细菌16S rRNA基因PCR扩增 采用通用引物27F/1492R进行细菌全序列16S rRNA扩增，引物序列如下：27F: (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)，1492R:(5’-ATGGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)使用同一DNA模板，PCR反应程序为：95 ℃变性2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，25个循环后；72 ℃ 2 min。反应结束后取5 μL 反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 DGGE电泳 采用DYY-8C型电泳仪对样品16S rRNA V3可变区的PCR扩增产物进行电泳。电泳条件：8%聚丙烯酰胺凝胶，变性剂梯度为30%～70%。在0.5%×TAE缓冲液中150 V恒压电泳5 h。电泳结束后，用Ethidium Bromide染料染色。

1.5 DGGE图谱优势条带序列分析 得到DGGE图谱后，将特征条带从胶上切下，取2 μL为模板，使用引物338F/518R进行PCR扩增，采用DNA快速纯化/回收试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)进行纯化分析，将纯化的产物送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 消化道菌群16S rRNA基因PCR扩增结果 从40日龄鸡群消化道各部位的内容物中提取的总DNA经电泳检测，所得DNA样品均在1 560 bp左右(见图1)，而且基本上没有拖尾现象。用PCR产物通过紫外分光光度计检测，D260 nm值均在1.8～2.0之间。可知鸡消化道内容物中DNA含量高、纯度高，说明DNA提取方法可行。

M:2 000 bp Marker ；1：空肠；2：回肠；3：直肠；4：盲肠；5：十二指肠；6：肌胃；7：腺胃；8：嗉囊图1 消化道菌群16S rRNA基因PCR扩增结果

2.2 消化道细菌16S rRNA基因V3区PCR扩增结果 对消化道菌群16S rRNA基因的PCR产物采用巢式PCR进行扩增，即以引物338F-GC和518R对得到的扩增产物进行二次PCR扩增，经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测后得到约为220 bp的DNA片段，见图2。

M:2 000 bp Marker；1：空肠；2：回肠；3：直肠；4：盲肠；5：十二指肠；6：肌胃；7：腺胃；8：嗉囊图2 消化道细菌16S rRNA基因V3区的PCR扩增结果

2.3 PCR产物纯化结果 采用DNA快速纯化/回收试剂盒对PCR产物进行纯化处理，并用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测(见图3)。从图3可以看出，经纯化处理后的PCR扩增产物均获得唯一的1条特异性片段，长度在220 bp左右，与PCR扩增结果相符，无拖尾及非特异性扩增片段，可用于后续的DGGE分析。

M:2 000 bp Marker；1：空肠；2：回肠；3：直肠；4：盲肠；5：十二指肠；6：肌胃；7：腺胃；8：嗉囊图3 消化道细菌16S rRNA基因V3区的PCR扩增结果

2.4 鸡群消化道不同部位DGGE图谱分析 取30 μL 产物在30%～70%变性梯度范围内进行DGGE，电泳条件为60 ℃恒温，150 V，6 h。经EB染色后经凝胶成像系统拍照，获得DGGE图谱见图4。

1：空肠；2：回肠；3：直肠；4：盲肠；5：十二指肠；6：肌胃；7：腺胃；8：嗉囊图4 消化道不同部位细菌16S rRNA基因PCR-DGGE凝胶图谱

2.5 鸡群消化道内容物菌群多样性分析 割胶回收测序结果发现，40日龄倒毛鸡消化道正常菌群为乳酸杆菌、球菌、类杆菌、真杆菌、梭菌及大肠杆菌等，其中乳酸菌分布广，而且数量众多，见表1。

表1 PCR-DGGE特异条带的基因片段序列的比对结果

3 讨论

3.1 贵州地方品种鸡消化道菌群分析意义 倒毛鸡是贵州著名的肉用型优良地方品种，被载入《中国家禽品种志表》，其体态秀丽，羽毛生长方式奇特，肉质细嫩，肉味鲜美，但抗病力较差，由于生理条件原因导致不耐寒，成活率低，生长慢。鸡肠道正常菌群种类多、数量大，在动物的营养消化吸收、免疫调节、机体发育和产品品质形成等方面起着重要的作用。本研究阐明鸡肠道菌群与饲料消化吸收的关系，以及开发研制禽类专用微生态制剂提供理论基础，也可以为其他实验研究提供参考[5，6]。

3.2 消化道主要正常菌群的定植规律 研究发现，在鸡胚时期整个消化道是无菌的。出壳后随着日龄的增加，消化道内需氧菌大量增殖，有些部位随后则被厌氧菌所取代。本试验通过PCR-DGGE指纹图谱和测序结果发现倒毛鸡在40 日龄时肠球菌、肠杆菌和乳酸菌已开始在消化道中定植，其中乳酸菌不仅分布于整个消化道，而且从条带亮度来看其数量众多；相比之下，直肠和盲肠的细菌种类最多也与其他部位存在明显差异。尽管如此，不同组别消化道相同部位的细菌种类也不完全一样。这些结果与相关文献报道一致。这种定植看起来盲目而又杂乱无章，但是在一定条件下是有规律可循的。这种规律是机体与外界微生物在长期进化过程中形成的一种相互适应性，也就是在一定条件下，某一种动物一出生，就出现与这些动物相适应的微生物的定植，随着该动物生理生化的完善而达到某一恒定值，并维持在一种相对的动态平衡状态之中。如某一动物的某一生理时期，必然有相应定植的正常菌群数。正常菌群在雏鸡消化道完成定植过程需 40 d 左右。消化道正常菌群定植完成以后，各部位的优势菌群均不完全相同。本试验着重研究各肠道主要正常菌群的动态定植过程，以期得出某些规律[7～9]。

[1] 张学余.中国养鸡业的生产现状与前景展望[J].中国禽业导刊，2005(3)：154．

[2] 吴常信. 中国家禽发展状况与未来整体规划. 中国禽业发展大会暨中国畜牧业协会禽业分会第二届会员代表大会论文集[C].北京：2007.

[3] 李悦.美国养鸡业历史进程对我国的启示[J].中国家禽，2011，33(5):63-66．

[4] 傅筑荫.贵州兴义矮脚鸡及应用前景[J].中国家禽，2000，22(9):35-36．

[5] 朱远春，查龙应，傅筑荫．贵州兴义矮脚鸡与矮脚黄鸡早期生长及屠宰性能的比较[J]．贵州农业科学，2004，32(3):19-21．

[6] 王文涛，朱莉丽，傅筑荫，等.贵州地方鸡种资源存在的问题及对策[J].贵州农业科学，2010，38(8):155-157．

[7] 王桂军，魏建忠，李郁．肠道共生微生物群落与家禽健康[J]．中国畜牧兽医，2007，34(2)：153-157．

[8] 汤天学．禽类胃肠道的防御机制(上)[J].养殖技术顾问，2010(3):154．

[9] 汤天学.禽类胃肠道的防御机制(下)[J].养殖技术顾问，2010(4):163．

Guizhou Local Breed Chicken Digestive Ttract Flora Structure Analysis

Wang Fan1, Xu Maowen2, Jin Zhiqiang1, Wen Ming2, Ou Deyuan2

(1.Animal Health Supervision and Inspection of Guiyang, Guiyang Guizhou 550081,China;2. College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang Guizhou 550025,China)

Wool chicken is high quality local breeds in Guizhou, with unique feathers and naming. Test using polymerase chain reaction - deformation gradient gel electrophoresis (PCR - DGGE) technology, about 40 days of age Wool chicken analyzed the structure of the digestive tract flora, the results showed that the wool chicken digestive tract day age 40 normal flora for lactic acid bacteria, staphylococcus aureus, bacillus, true, clostridium and escherichia coli, bacillus of lactic acid bacteria, wide distribution and large numbers.

Wool Chicken; Digestive Tract; Flora Structure; PCR - DGGE

2015-12-16

贵阳市农业科技项目(筑科合同[2012102]3-19号)

王凡(1974 — )，男，高级兽医师，主要从事动物疫病诊断与防治工作。

*通讯作者：文明 (1969 — )，教授，博士，从事预防兽医学研究。

E-mail: as.mwen@gzu.edu.cn

S831.1

A

1007-1474(2016)02-0005-04