多指标综合评价重庆不同产区桔梗药材的质量

黄娇++姜登军

摘要：对重庆不同产区桔梗多个指标成分的含量进行测定，并对其质量进行综合评价。按照《中国药典》方法测定水分、总灰分、醇浸出物，采用UV法测定总黄酮、总皂苷、总多糖的含量，采用HPLC-ELSD法测定桔梗皂苷D的含量，并运用主成分分析法和相关性分析法对各个指标进行综合评价。相关性分析表明，不同指标间有一定的相关性。对多个指标成分进行评价，运用主成分得分得出开县产桔梗质量最优。通过主成分分析法和相关性分析法对不同产区桔梗药材质量进行综合评价，可为重庆产桔梗资源的开发利用提供理论依据。

关键词：桔梗；综合评价；相关性分析；主成分分析

中图分类号： S567.02文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0301-05-0389-04

收稿日期：2015-04-15

基金项目：重庆市教委科学技术研究项目（编号：K131801）。

通信作者：黄娇（1982—），女，海南海口人，硕士，讲师，主要从事中药质量分析研究。E-mail：huangjiao1108@126.com。中药材桔梗为桔梗科植物桔梗[Platycodon grandiflorum （Jacq.） A. DC.]的干燥根[1]，是药食两用的药材品种，主要用于治疗咳嗽痰多、胸闷不畅、咽痛、音哑、肺痈吐痰、疮疡脓成不溃等症[2]。桔梗的化学成分主要含有皂苷类、黄酮类、酚类化合物、聚炔类化合物、甾醇类、多聚糖、挥发油、脂肪油及脂肪酸、维生素、氨基酸及微量元素[3]。相关学者对桔梗中多种成分，特别是三萜皂苷类成分的药理活性进行了较多研究[4-6]，目前，药典单以桔梗皂苷D含量来判断桔梗药材的质量优劣并不能反映真实情况，因为中药疗效是多种成分协同作用的结果。已有关于不同产地桔梗有效成分含量方面的研究报道[7-9]，但多指标应用于桔梗药材质量综合的评价尚未见报道。

桔梗在中国主产于安徽、河南、湖北、辽宁、吉林、河北及内蒙古等省（区），以东北、华北产量较大，称为北桔梗，华东地区产品质量最佳，称为南桔梗，南北皆适于种植[10]。重庆地处西南，地形垂直高差大，生态环境呈现多样性，生态类型丰富多样，生物物种非常丰富。由于其得天独厚的地理气候条件，中药资源非常丰富，素有中草药王国和天然药库之称。重庆有不少区县种植桔梗，为了进一步扩大重庆产桔梗资源的开发，保证商品药材及相应制剂的稳定性，本试验拟对收集的桔梗药材进行多指标成分的测定，为重庆产桔梗药材资源的合理使用及GAP种植提供借鉴和参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

桔梗皂苷D标准品（批号：MusT-13082211），购自成都曼思特生物科技有限公司；乙腈，色谱纯；甲醇、乙醇、正丁醇、甲酸、冰醋酸、高氯酸、香草醛，分析纯，川东化工集团有限公司化学试剂厂；超纯水，自制。

本试验桔梗药材样品采自2013年重庆8个区县（表1）共20批，药材采集后清洗去除泥沙，刮去根皮后干燥，即得桔梗样品，并经重庆万州食品药品检验所鉴定为桔梗科桔梗属植物桔梗[Platycodon grandiflorum （Jacq. ） A. DC.]的根。

1.2仪器与设备

岛津LC-20A高效液相色谱仪；ELSD-LTII检测器；岛津工作站；KQ-250B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；梅特勒ME215S十万分之一电子天平；梅特勒CP224S万分之一电子天平；紫外UV-2550，日本岛津公司；超声波清洗仪SD3200，昆山市超声仪器有限公司；LK-COOA摇摆式高速中药粉碎机。

1.3方法

1.3.1水分测定按照《中国药典》2010版1部附录ⅨH第1法，取不同批次的桔梗样品（过2号筛）2.0 g测定。

1.3.2总灰分测定精确称取桔梗粉末（过2号筛）3.0 g，按照《中国药典》2010版1部附录ⅨK灰分测定法测定。

1.3.3浸出物测定精确称取桔梗粉末（过2号筛）2.0 g，置于150 mL锥形瓶中，精确加水100 mL，按照《中国药典》2010版1部附录XA项下醇溶性浸出物测定法的热浸法测定。

1.3.4桔梗总皂苷含量测定[11]精确称取桔梗皂苷D 5.65 mg，加甲醇溶解并稀释制成浓度为0.565 mg/mL的标准品溶液。精确称取干燥桔梗药材粉末2.0 g，加入11倍90%乙醇，超声提取30 min，超声温度为45 ℃进行提取，残留物加甲醇溶解定容于容量瓶中备用。分别吸取200 μL，在473 nm处测定吸收度，计算出总皂苷的含量。

1.3.5桔梗总黄酮含量测定[11]精确称取芸香苷对照品15.70 mg，加甲醇溶解并稀释制成浓度为0.157 mg/mL的标准品溶液，精确称取1.0 g桔梗粗粉，置于100 mL锥形瓶中，加入90%甲醇溶液50 mL，超声提取45 min，放冷过滤定容于100 mL容量瓶中，作为供试品溶液。在510 nm处测定吸收度，计算出总黄酮的含量。

1.3.6桔梗总多糖含量测定[7]精确称取葡萄糖标准品15.23 mg，加蒸馏水溶解并稀释制成0.152 3 mg/mL的标准品溶液。精确称取桔梗样品1.0 g，置于100 mL容量瓶中，超声提取45 min。精确量取续滤液20 mL蒸干，加水溶解，加10 mL无水乙醇放置12 h，抽滤，沉淀用90%乙醇洗涤，沉淀用水溶解定容至50 mL量瓶，摇匀，即得供试品溶液。在486 nm 处测定吸收度，计算出总多糖的含量。

1.3.7桔梗皂苷D含量测定

1.3.7.1色谱条件色谱柱：phenomenex-C18色谱柱；流动相：流动相乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B）；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL。梯度洗脱程序：0.01～10 min，20%A；10～54 min，33%A；54～66min，4%A。

1.3.7.2标准品溶液的制备精确称取桔梗皂苷D标准品4.93 mg置于10 mL量瓶中，加90%甲醇稀释至刻度，过 0.45 μm 微孔滤膜滤过即得，进样20 μL。

1.3.7.3供试品溶液的制备[12]取各桔梗药材粉末（过2号筛），精确称取2 g，置锥形瓶中，精确加入90%甲醇50 mL，超声提取30 min，放冷，取续滤液过0.45 μm微孔滤膜滤过即得。

2结果与分析

2.1桔梗皂苷D含量测定方法学考察

2.1.1线性关系的考察分别精确吸取标准品溶液1、5、10、15、20、25 μL注入液相色谱仪。按“1.3.7.1”节下色谱条件，测得桔梗皂苷D峰面积积分值，以标准品溶液进样量的自然对数为横坐标（x），峰面积积分值的自然对数为纵坐标（y）进行回归，得到桔梗皂苷D的线性回归方程为：y=0985x+11.886，r=0.999 2；表明桔梗皂苷D在0.491～12276 μg范围内峰面积与进样量呈良好的线性关系。

2.1.2精密度试验取1号供试品溶液重复进样5次，进样20 μL，计算桔梗皂苷D的峰面积RSD为1.26%，表明方法精密度良好。

2.1.3稳定性试验分别取1号供试品溶液0、2、4、8、12、24 μL，进样20 μL，桔梗皂苷D的峰面积RSD为093%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.1.4重复性试验取同一批药材（1号），按照“1.3.7.3”节下制备6份供试品溶液，依照同样色谱条件测定桔梗皂苷D含量平均值为0.56%，RSD为2.83%，表明此方法符合方法学要求。

2.1.5加样回收率试验精确称取2 g 1号桔梗药材粉末5份（桔梗皂苷D含量为0.56%），分别精确加入桔梗皂苷D标准品1 mL（含桔梗皂苷D 0.491 mg），按供试品的制备方法处理，计算回收率，桔梗皂苷D 5份样品的平均回收率为9958%，RSD为1.09%，表明此法的回收率较高。

2.2系统适应性试验

在“1.3.7.1”节下色谱条件对对照品进行测定，记录色谱图（图1）。

2.3桔梗皂苷D的含量测定

分别取不同产区的桔梗药材，按照“1.3.7.3”节下方法制成样品溶液，精确吸取供试品溶液20 μL，注入色谱仪（图2），桔梗皂苷D含量测定结果见表1。

2.4不同产地桔梗各项指标测定结果分析

从表1可以看出，20批桔梗样品水分和总灰分均符合现行《中国药典》的规定，醇浸出物的含量在17.84%～35.62%，

总多糖的含量在13.06%～58.70%，总皂苷的含量在6.99%～12.47%，总黄酮的含量在0.26%～0.53%，桔梗皂苷D的含量在0.41%～0.77%，不同产区的桔梗指标性成分含量有明显差异。

2.5相关性分析

采用SPSS 19.0对上述指标间进行相关性分析（表2），从表2可以看出，桔梗药材的水分和总灰分与其他指标之间的相关不显著；总多糖和浸出物之间呈极显著相关；总皂苷和浸出物之间呈极显著相关；总黄酮和浸出物之间呈显著相关；桔梗皂苷D和浸出物之间呈显著相关；总多糖和总黄酮之间呈极显著相关，总皂苷和总黄酮之间呈极显著相关；总皂苷和桔梗皂苷D之间呈极显著相关；总黄酮和桔梗皂苷D间呈极显著相关。

2.6主成分分析

大量研究表明，应用主成分分析和模糊数学方法建立的数学模型进行中药材的质量评价是可行的[13-16]。本研究采用SPSS 19.0对20批桔梗药材的水分、总灰分、醇浸出物、总黄酮、总皂苷、总多糖以及桔梗皂苷D的含量等测定数据进行主成分分析。成分1、2的特征值占总方差的百分比为 74.927%，选取了前2个因子作为主成分，代表主要的桔梗质量指标。第1主成分以醇浸出物、总黄酮、总皂苷、总多糖以及桔梗皂苷D的含量贡献较大；第2主成分以水分含量贡献较大。从图3可以看出，距离原点较远的几个点就是主成分1和2中权重值大的成分，表明其在决定产地差异中的重大作用。

综合主成分得分越高，相应的评价样本质量就越优。由得分图可见不同产地的桔梗药材得分不同，提示桔梗药材的质量与地域分布有关，不同产地桔梗药材的质量之间存在着明显的差异。综合得分11号开县关面乡产的桔梗药材质量最优，15号样品质量最差（图4）。

2.7聚类分析验证

为了验证综合主成分分析结果的可靠性及客观性，采用系统聚类法对其进行验证。对20批桔梗药材的水分、总灰分、醇浸出物、总黄酮、总皂苷、总多糖以及桔梗皂苷D原始数据标准化处理后进行系统聚类分析，本试验的综合主成分分析结果与原始数据的聚类分析结果呈现相似规律，20批桔梗样品可以分为2类，其中 10、11、19号样品聚为一类，在综合排名中排名前3，得分比其他样品略高，质量最优；在剩下的样品中，综合排名较后，质量较差（图5）。

3结论与讨论

本研究对桔梗的水分、总灰分及醇溶性浸出物进行检测，同时对总黄酮、总皂苷、总多糖以及桔梗皂苷D的含量测定，建立全面的桔梗药材质量评价体系，并通过此体系综合分析不同产区桔梗药材的质量差异。通过对此体系进行分析，不同产区桔梗醇溶性浸出物都在17%以上，水分不超过15%，总灰分不超过5%，桔梗皂苷D的含量都大于0.1%，所有样品都能符合《中国药典》2010 版标准，质量较好。

运用相关性分析对20批桔梗药材进行分析评价，结果表明，20批桔梗中水分、总灰分、浸出物以及指标性成分都有明显差异。相关性分析中可以得到桔梗药材的水分和总灰分与其他指标之间的相关性不显著；总多糖和浸出物之间呈极显著相关；总皂苷和浸出物之间呈极显著相关；总黄酮和浸出物之间呈显著相关；桔梗皂苷D和浸出物之间呈显著相关；总多糖和总黄酮之间呈极显著相关，总皂苷和总黄酮之间呈极显著相关；总皂苷和桔梗皂苷D之间呈极显著相关。三萜皂苷类是桔梗的主要活性成分与特征性成分[3]，不同产区的桔梗总皂苷和单体皂苷的含量有差异，符合药用植物体内总皂苷含量的积累和皂苷的组成与植物生长发育紧密相关，药用

植物体内的皂苷是动态变化的，来源不同产区的同种中药材，含有的特定的药效成分皂苷含量就有可能不同，包括皂苷总含量和皂苷的组成[17]。黄酮类化合物具有降血压、抑制血小板聚集、抗骨质疏松、抗心律失常、抗过敏、抗缺氧等多种药理及保健作用[18]。现代药理学研究发现桔梗多糖具有很好的抗肿瘤和增强机体免疫活性的作用[19-20]，多糖含量直接影响其药效的发挥，多糖也是桔梗食用品质的主要评价指标。本试验得到的总多糖、总黄酮、总皂苷之间呈极显著相关性，可能和桔梗体内代谢的生物合成过程有关。影响桔梗体内多种成分积累的因素比较复杂，可能是多种生态因子如温度、土壤等协同作用的结果。

采用主成分分析法能够筛选出共有的特征成分，指导发现决定性要素，较以往单一评价指标得到的结果更为系统，能较为全面地反映桔梗药材的质量状况，各主成分的贡献率是通过分析原始数据计算得到，克服了其他综合评价方法中人为确定各指标权重的问题，结果客观公正[13]。从评价结果看，11号样品综合主成分F值最高，质量最好；15号样品综合主成分F值最低，质量最差。本试验中运用 PCA-CA模式识别分析方法，能更全面地判别桔梗药材的优劣，为桔梗药材的进一步利用提供了可靠的理论依据。

植物生存环境中的生态因子可分为生物因子和非生物因子。皂苷类和黄酮类化合物都是植物体内重要的次生代谢物，其量和组成随着植物的遗传背景、组织类型、生长年龄、生理状况以及环境因子的变化而发生显著变化，而其量和组成的变化又取决于合成途径中的一些关键酶及其在细胞中的表达水平[21-24]。植物的次生代谢产物，在植物体内的积累很大程度上受生长环境各因素的直接或间接影响。后续将对影响桔梗次生代谢物积累的关键生态因子进行深入研究。

试验结果表明，不同产区桔梗药材的多指标含量之间存在不同程度的差异，相同产区也存在一定差异，可能与气候、土壤、海拔、采集时间、生长年限等有一定的关系，在一定程度上反映了桔梗药材的质量特性。通过主成分分析发现，不同产区的样品综合主成分值存在较大差异，相同产区也存在一定差异，可能与产区栽培水平参差不齐有关，所以规范化栽培技术是确保中国药材质量的重要举措[21]。扩大重庆桔梗资源的开发，就必须加强各产区规范化种植技术和管理。中药材的品种具有“一脉相承”“沿革变迁”的特点，产地是影响中药材质量的重要因素[25]。桔梗在我国许多地区均有分布，而不同产地环境因子均有较大差异，这势必会对桔梗的生长及药材品质造成影响。加大收集代表性桔梗样品，采用质谱等先进方法，进一步对桔梗体内代谢产物成分筛选，并结合药效、分子生物学等方面进行综合比较研究，可使桔梗质量评价体系更加完善。

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